Anticuerpos anti-NIK y sus usos.

Preparación que comprende anticuerpos policlonales y/o fragmentos de F(ab')2 de los mismos,

en donde losanticuerpos se generan contra un péptido que consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID n.º 12.

Anticuerpos anti-NIK y sus usos Campo de la invención La presente invención se refiere a moléculas inmunorreguladoras. Más en particular, la presente invención se refiere 5 a anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tal y como se definen en las reivindicaciones capaces de fijarse específicamente a la cinasa que induce el NF-κB (NIK) /MAP3K14, o a una porción específica de la misma.

Antecedentes de la invención No existe tratamiento ni ningún tratamiento satisfactorio para las numerosas enfermedades muy debilitadoras y/o mortales asociadas a una falta de regulación de la actividad de las moléculas de NF-κB, entre ellas las enfermedades malignas y las enfermedades asociadas a respuestas inmunitarias patológicas, tales como enfermedades autoinmunitarias, alérgicas, inflamatorias y relacionadas con trasplantes.

Las moléculas de la familia de la NF-κB son complejos que actúan como factores de transcripción eucariotas decisivos para la regulación de las respuestas inmunitarias, del crecimiento celular y de la supervivencia (Ghosh S. et al., 1998. Annu Rev Immunol. 16: 225-60) que se pueden activar por inducción mediante casi todos los miembros 15 de la familia de receptores de TNF/NGF. Las moléculas de NF-κB suelen estar aisladas en el compartimento citoplasmático mediante asociación física a una familia de inhibidores citoplasmáticos ricos en ankirina denominados IκB, que incluyen IκBα y proteínas relacionadas (Baldwin A. S. Jr., 1996. Annu Rev. Immunol. 14: 649-83) . En respuesta a los diversos estímulos, que incluyen citocinas, mitógenos y determinados productos génicos víricos, el IκB se fosforila rápidamente en la Ser32 y en la Ser36 y se ubicuitina, y se degrada posteriormente en el proteasoma 20 26S. Esto permite que el NF-κB liberado se traslade al núcleo y participe en la transactivación del gen diana (Mercurio F. y Manning A. M., 1999. Curr Opin Cell Biol. 11: 226-32; Pahl, H. L., 1999. Oncogene 18: 6853-66) . Los recientes estudios de clonación molecular han identificado un complejo cinasa de IκB (IKK) con varias subunidades que interviene en la fosforilación de IκB, el inhibidor de NF-κB, inducida por señal. El complejo IKK está compuesto por dos subunidades catalíticas, IKKα e IKKβ, y una subunidad reguladora IKKγ (NEMO) . La actividad catalítica de 25 IKKα e IKKβ se puede activar mediante muchos inductores diferentes de NF-κB, entre ellos las citocinas inflamatorias tales como el factor de la necrosis tumoral (TNF) y la interleucina (IL) -1, el receptor de los linfocitos T (TCR) y la proteína coestimuladora de los linfocitos T, CD28 (Karin, M. y Ben-Neriah, Y., 2000. Annu Rev Immunol.

18: 621-63) .

La cinasa que induce el NF-κB (NIK, por su nombre en inglés) /MAP3K-14 (Publicación de patente internacional de la WIPO n.º WO9737016A1 para los presentes inventores) es decisiva para la activación del NF-κB. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión de la NIK conduce a una activación considerable del NF-κB (revisado en Wallach

D. et al., 2002. Arhtritis Res 4 Supl 3: S189-96) y se ha demostrado que la expresión de mutantes de NIK catalíticamente inactivos conduce a una inhibición eficaz de la activación del NF-κB en respuesta a una serie de activadores conocidos de NF-κB, tales como LMP1, receptor del TNF (TNFR) -1, TNFR-2, RANK, receptor Toll 35 humano, CD3/CD28, receptor de la IL-1 (IL-1R) , proteína Tax del virus linfótropo de los linfocitos T humanos (HTLV) 1 y lipopolisacárido (LPS) (Malinin, N. L. et al., 1997. Nature 385: 540-4, Sylla, B. S. et al., 1998. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 10106-11; Darnay, B. G. et al., 1999. J Biol Chem. 274: 7724-31; Lin, X. et al., 1999. Immunity 10: 271-80; Geleziunas, R. et al., 1998. Mol Cell Biol. 18: 5157-65) . La interrupción selectiva del gen de la NIK (Yin, L. et al., 2001. Science 291: 2162-5) y el estudio de la cepa de ratón de la 'alinfoplasia' (aly) que lleva una mutación natural 40 puntual de aminoácido Gly855Arg en la NIK (Shinkura, R. et al., 1999. Nat Genet. 22: 74-7) reveló que la NIK tiene una función esencial en el desarrollo de los órganos linfáticos. Los ratones aly/aly y con genosupresión del gen de la NIK manifiestan una ausencia sistémica de ganglios linfáticos y de placas de Peyer, desorganización de la estructura del timo y del bazo e inmunodeficiencia cuyas características más destacables son poca cantidad de inmunoglobulinas en el suero y ausencia de rechazo al injerto (Shinkura R. et al., 1999. Nat Genet. 22: 74-7) . Estas 45 anomalías reflejan aparentemente la señalización aberrante de una serie de receptores. Las deficiencias de desarrollo de los ratones con NIK mutante se parecen a las encontradas en los ratones carentes del receptor de LTβ (LT-βR) , lo que sugiere que la NIK también participa en la señalización mediante este receptor concreto. La peor capacidad proliferativa de los linfocitos B en los ratones aly/aly se pudo demostrar que estaba correlacionada con una falta de respuesta de estas células al LPS y al ligando de CD40 (CD40L; Garceau, N. et al. 2000. J. Exp Med.

191: 381-6) y la presencia de una cantidad excesiva de linfocitos B1 en la cavidad del peritoneo de los ratones se podría adscribir a la falta de migración dirigida de las células peritoneales al sistema de tejidos linfáticos asociados a la mucosa intestinal (GALT, por su nombre en inglés) como una consecuencia de una señalización deficiente del receptor de las quimiocinas en el tejido linfático secundario (Fagarasan, S. et al., 2000. J. Exp Med. 191: 1477-86) .

Recientemente, en los estudios realizados por Wallach et al., se ha demostrado que NIK interviene de forma general

e importante en la señalización del receptor de las citocinas, y estos autores han demostrado, utilizando un sistema de doble híbrido, que la cadena γ del receptor de la IL-2, o una «cadena γ común», que es una componente de la señalización de los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15 e IL-21, está asociada específicamente a la NIK (PCT/IL 03/00317) . La sobreexpresión de la cadena γ común se encontró que potenciaba la activación del NF-κB mediada por NIK y, tras la estimulación con IL-2 o IL-15, se encontró que NIK y los componentes del señalosoma se fijan a la cadena γ común. Por lo tanto, estos resultados indican que NIK interviene en la señalización a través de la gran variedad de receptores de citocinas que comprenden la cadena γ común como subunidad de señalización.

Aparte de estas y otras contribuciones a la regulación del desarrollo y el funcionamiento del sistema inmunitario, la NIK también participa en la regulación de diferentes funciones no inmunitarias. Los ratones aly/aly (pero no la 5 genosupresión de NIK) presentan una desarrollo deficiente de las glándulas mamarias (Miyawaki S. et al., 1994. Eur

J. Immunol. 24: 429-34) . Además, los estudios in vitro han implicado a la NIK en la señalización que conduce a la diferenciación de las células del músculo esquelético (Canicio, J. et al. 2001. J Biol Chem. 276: 20228-33) y a la supervivencia y diferenciación de las neuronas (Foehr. E. D. et al., 2000. J. Biol. Chem. 275: 34021-4) .

En concordancia con la función que se le ha asignado a la NIK como mediadora de la activación del NF-κB, los fibroblastos procedentes de ratones aly/aly y con genosupresión de NIK no lograron activar el NF-κB en respuesta a la activación de LT-βR. Además, la inducción de VCAM-1 debida a LT-βR, que se produce por la activación del NFκB, es anormal en los fibroblastos embrionarios de ratones aly/aly (FER; Matsumoto, M. et al., 1999. J. Immunol. 163: 1584-91) . También se ha observado la falta de fosforilación de IκB en la respuesta de los linfocitos B de aly/aly a la ligación del CD40. En cambio, en las células dendríticas de estos ratones, la fosforilación de IκB inducida por CD40

aparecía normal (Garceau, N. et al. 2000. J. Exp Med. 191: 381-6) . Las células peritoneales de aly/aly también son incapaces de responder a la quimiocina SLC con un incremento de la actividad de NF-κB (Fagarasan, S. et al. 2000. J Exp Med. 191: 1477-86) .

La valoración del patrón de la especie de NF-κB expresada en los órganos linfáticos de los ratones aly/aly indicó que, además de intervenir en la regulación del complejo o de los complejos de NF-κB que comprenden las proteínas ReI 20 (A+p50) e IκB, la NIK también participa en el control de la expresión/activación de otras especies de NF-κB. Más notablemente, los linfocitos de aly/aly carecen de p52, una especie de NF-κB... [Seguir leyendo]

1. Preparación que comprende anticuerpos policlonales y/o fragmentos de F (ab') 2 de los mismos, en donde los anticuerpos se generan contra un péptido que consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID n.º 12.

2. Preparación de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo de 5 IgG.

3. Preparación de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es de origen murino.

4. Preparación de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, capaz de detectar específicamente la NIK mediante:

(a) análisis de inmunotransferencia Western;

(b) ELISA; o

(c) inmunoprecipitación.

5. Preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los anticuerpos se preparan mediante la inmunización de un mamífero no humano con un péptido que consiste en la secuencia aminoacídica 15 presentada en la SEQ ID n.º 12.

6. Preparación de acuerdo con la reivindicación 5, capaz de detectar la NIK murina.

7. Preparación de acuerdo con la reivindicación 5, preparada mediante la inmunización de un roedor.

8. Método para preparar un anticuerpo monoclonal anti-NIK que comprende la inmunización de un mamífero no humano con un péptido, que es parte de una secuencia aminoacídica de la NIK, y que es la SEQ ID n.º 12.

9. Anticuerpo monoclonal producido por el clon de hibridoma Pep 12-629-62-18, depositado en el CNCM con el n.º I-3094.

10. Clon de hibridoma depositado en el CNCM con el n.º I-3094.

11. Composición de materia que comprende un sustrato unido covalentemente a un polipéptido que consiste en

la secuencia aminoacídica de SEQ ID n.º 12, capaz de capturar selectivamente un anticuerpo o fragmento de 25 anticuerpo capaz de fijarse específicamente a la SEQ ID n.º 12.

12. Composición de materia de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sustrato es una matriz de cromatografía de afinidad.

13. Composición de materia de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde dicho sustrato comprende un glúcido o un derivado de dicho glúcido.

14. Composición de materia de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho glúcido se selecciona del grupo que consiste en agarosa, sefarosa y celulosa.

15. Composición de materia de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sustrato se selecciona del grupo que consiste en una perla, una resina o una superficie plástica.

16. Procedimiento para preparar un anticuerpo monoclonal anti-NIK, que comprende hacer crecer un hibridoma

clonado que comprende hacer crecer el clon de hibridoma Pep12-629-62-18, depositado en el CNCM con el n.º I3094, en medio líquido o en abdomen de mamífero para permitir que el hibridoma produzca y acumule el anticuerpo monoclonal.

17. Procedimiento in vitro para la purificación de una proteína de fijación a NIK, que comprende poner en contacto una muestra que contiene la NIK y la proteína de fijación a la NIK con una preparación de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, que coinmunoprecipita la NIK y la proteína de fijación a NIK, lavar el complejo inmunitario producido, y recuperar la proteína fijada a la NIK a partir del complejo inmunitario utilizando un péptido competidor procedente de NIK.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la muestra se selecciona de líquidos corporales, extractos celulares y genotecas de expresión de ADN.

19. Uso de una preparación de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, para el desarrollo de un ensayo de ELISA.

20. Uso de una preparación de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, para la purificación inmunitaria de la NIK.