Anticuerpos antagonistas contra Ephb3.

Un anticuerpo antagonista específico para EphB3 monoclonal que no inhibe la unión de efrina B2 a receptorEphB3 pero que reduce el nivel de fosforilación de EphB3.

Anticuerpos antagonistas contra Ephb3

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a anticuerpos antagonistas para EphB3 que pueden usarse en procedimientos para prevenir y tratar enfermedades o trastornos relacionados con EphB3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

EphB3 es un receptor en la familia de tirosina cinasa de receptores de efrina. Actualmente hay 14 receptores de Eph y 9 ligandos de efrina conocidos en seres humanos. Los receptores de efrina (Eph) y sus ligandos, las efrinas, median en numerosos procesos de desarrollo, particularmente en el sistema nervioso y sistemas vasculares. Las efrinas también son conocidas por desempeñar una función en el desarrollo tumoral, angiogénesis, crecimiento metastásico y supervivencia celular. Basándose en sus estructuras y relaciones de secuencia, las efrinas se dividen en la clase de efrina-A (EFNA) , que están ancladas a la membrana por un enlace glucosilfosfatidilinositol, y la clase de efrina-B (EFNB) , que son proteínas transmembrana. La familia de Eph de receptores se divide en 2 grupos basándose en la similitud de sus secuencias de dominio extracelular y sus afinidades para unirse a ligando de efrina-A y efrina-B. Los receptores de Eph constituyen el mayor subgrupo de la familia de receptores tirosina cinasa (RTK) .

Parece que las Eph funcionan señalizando tras la activación. La unión a efrina induce la oligomerización de receptores de Eph provocando la fosforilación de residuos de yuxtamembrana de Eph. Las Eph activadas tienen múltiples tirosinas fosforiladas que actúan de sitios de enlace para la señalización de proteínas (por ejemplo, proteínas que contienen RasGAP, Src, LMW-PTP, PLCg, PI3-cinasa, Grb2 y PDZ) .

La expresión en exceso de receptores de Eph (EphA1, EphA2, EphB2) produce la transformación en ausencia de hiper-fosforilación de receptores. Los receptores EphB fosforilados regulan negativamente la ruta de Ras-MAPcinasa y la señalización de FAK, alterando el crecimiento celular.

EphB3 participa desempeñando una función en una variedad de estados de enfermedad, por ejemplo, documentos WO 2004/005457, WO 03/087841, EP 1400807, Surawska y col., Cytokine & Growth Factor Reviews 15:419-433. Por ejemplo, la expresión de EphB3 está asociada a la hiperplasia característica y atrofia vellosa observada en celiaquía (Diasdado y col., Gut, 53 (7) : 944-951 (2004) ) . También se ha sugerido que EphB3 es neuroprotector en accidente cerebrovascular y enfermedad neurodegenerativa. La regulación por incremento de la expresión de EphB3 después de lesión puede también contribuir a un ambiente en la médula espinal que es inhibidor para la regeneración axonal (Willson y col., Cell Transplant, 12 (3) :279-90 (2003) ) . Se observa que un ligando de EphB3, efrina B2, se regula por incremento en enfermedad angiogénica ocular (Ozaki y col., Am. J. Opthalmol., 138 (2) :2709 (2004) ) .

Así, existe una necesidad de identificar composiciones y procedimientos que modulen EphB3 y su función en tales enfermedades. La presente invención se refiere a estas, además de a otras, necesidades importantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La secuencia de nucleótidos para EphB3 se expone en SEC ID Nº: 1, y la secuencia de aminoácidos se expone en SEC ID Nº: 2. El dominio extracelular (DEC) consiste en los aminoácidos 1 a 559 de SEC ID Nº: 2. Alternativamente, el DEC consiste en 34 a 555 de SEC ID Nº: 2 (obsérvese que hay dos números de sitios correspondientes a EphB3 humano en la base de datos NCBI Entrez de secuencias de proteínas. En ambos casos, los investigadores hicieron predicciones presentando las secuencias en cuanto a (a) el número de aminoácidos codificados por la región codificante desde el codón de iniciación ATG al codón de terminación; (b) qué estiramiento de aminoácidos en esa secuencia precursora representa la secuencia señal de la secreción (esta secuencia se cortaría durante el proceso de maduración para crear la proteína madura) ; y (c) qué estiramiento de residuos representa la región transmembrana. Como el dominio “extracelular” de la proteína madura es cualquier cosa que se encuentre entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, la extensión predicha del DEC depende de dónde se coloque la señal y regiones TM. Ambas presentaciones de sitios (NP_004434 y P54753) predicen que el precursor tiene 998 aminoácidos de longitud, y que la señal de secreción abarca los residuos 1- 33. Así, ambas están de acuerdo en que el inicio del DEC es el residuo 34. Sin embargo, no están de acuerdo en el inicio de la región TM: NP_004434 predice que el inicio es el residuo 556 (haciendo el extremo del DEC en el número de aminoácido 555) , mientras que P54753 predice que TM empieza en el residuo 560 (haciendo el extremo del DEC en el número de aminoácido 559) ) . Como se describe en los ejemplos en el presente documento, un DEC que consiste en los aminoácidos 37558 se usó para inmunizaciones para la generación de anticuerpos.

La invención proporciona un anticuerpo antagonista monoclonal específico para EphB3 que no inhibe la unión de efrina B2 al receptor EphB3, pero que reduce el nivel de fosforilación de EphB3.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une al mismo epítope de EphB3 que el anticuerpo XPA.04.017. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende 6 CDR del anticuerpo XPA.04.017, que se unen el dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo manipulado humano, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención de al menos un aminoácido dentro de una CDR está sustituido con un residuo correspondiente de una CDR correspondiente de otro anticuerpo anti-EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención de uno o dos aminoácidos dentro de una CDR se ha modificado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención retiene una identidad del 97, 98 ó 99% con respecto a tanto la región ligera como pesada variable para el anticuerpo XPA.04.017. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende una región constante de una secuencia de anticuerpo humano y una o más regiones estructurales variables de la cadena pesada y ligera de una secuencia de anticuerpo humano, por ejemplo, en la que la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia humana individual, una secuencia consenso humana, una secuencia de la línea germinal humana individual, o una secuencia de la línea germinal consenso humana.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la fosforilación de EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la dimerización de EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la activación de receptor inducida por ligando de EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la señalización de EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la unión de efrina B1 a EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención la unión de efrina B3 a EphB3. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la proliferación de una célula intestinal. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención inhibe la proliferación de una célula vascular. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención promueve la proliferación de una célula neuronal. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención está conjugado con otro agente de diagnóstico o terapéutico.

Los materiales y procedimientos de la presente invención satisfacen las necesidades anteriormente mencionadas y otras relacionadas en la materia. La invención se refiere generalmente a anticuerpos antagonistas para EphB3 que reducen la actividad del receptor EphB3, procedimientos de preparación de tales anticuerpos y procedimientos de uso de anticuerpos antagonistas para EphB3 para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con EphB3.

En una realización se proporciona un anticuerpo antagonista que se une el dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos y compite con cualquiera de los anticuerpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, o XPA.04.019 por unirse a EphB3 más del 75%. Por el término “afinidad (KD) de 10-6 M o menos” se indica una afinidad de, por ejemplo, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M , 10-11 M o 10-12 M (es decir, un número inferior a 10-6 M) . En otra realización, el anticuerpo antagonista se une al mismo epítope de EphB3 que cualquiera de los anticuerpos XPA.04.017, XHA.05.172,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo antagonista específico para EphB3 monoclonal que no inhibe la unión de efrina B2 a receptor EphB3 pero que reduce el nivel de fosforilación de EphB3.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se une al mismo epítope de EphB3 que el anticuerpo XPA.04.017, en el que XPA.04.017 comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4.

3. Un anticuerpo antagonista según la reivindicación 1 que comprende 6 CDR del anticuerpo XPA.04.017, en el que XPA.04.017 comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4, que se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo manipulado humano, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un fragmento de anticuerpo.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un aminoácido dentro de una CDR está sustituido con un residuo correspondiente de una CDR correspondiente de otro anticuerpo anti-EphB3.

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se han modificado uno o dos aminoácidos dentro de una CDR.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que retiene al menos el 97, 98 o el 99% de identidad con respecto a tanto la región ligera como pesada variable con el anticuerpo XPA.04.017, en el que XPA.04.017 comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una región constante de una secuencia de anticuerpo humano y una o más regiones estructurales variables de las cadenas pesadas y ligeras de una secuencia de anticuerpo humano.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en el que la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia humana individual, una secuencia consenso humana, una secuencia de la línea germinal humana individual o una secuencia de la línea germinal consenso humana.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región constante de la cadena pesada es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada o sin modificar, un fragmento de las mismas, o combinaciones de las mismas.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una afinidad de unión de 10-7 , 10-8 ó 10-9 M o menos por EphB3.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una sustitución conservativa en las CDR.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un cambio conservativo o no conservativo en los residuos de riesgo bajo y moderado.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región constante de la cadena ligera es una región constante de la cadena ligera lambda modificada o sin modificar, una región constante de la cadena ligera kappa, un fragmento de las mismas, o combinaciones de las mismas.

15. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe la fosforilación de EphB3.

16. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe la dimerización de EphB3.

17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe la activación de receptor inducida por ligando de EphB3.

18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe la señalización de EphB3.

19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe la unión de efrina B1 a EphB3.

20. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe la unión de efrina B3 a EphB3.

21. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que inhibe la proliferación de una célula intestinal.

22. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que inhibe la proliferación de una célula vascular.

23. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que promueve la proliferación de una célula neuronal.

24. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está conjugado con otro agente de diagnóstico o terapéutico o toxina.

25. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 que se purifica a al menos el 95% de homogeneidad en peso.

26. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 25 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 15

27. Un kit que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo, envasado en un recipiente, conteniendo opcionalmente dicho kit un segundo agente terapéutico, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el contenido del recipiente y proporcionando indicaciones y/o instrucciones referentes al uso del contenido del recipiente para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con EphB3.

28. El kit de la reivindicación 27, en el que el recipiente es un vial o botella o jeringuilla precargada.