Anticuerpo humanizado.

Un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que reconoce y se une a la proteína ß-amiloide,

en el quedicho anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende:

i) una Región Variable de la Cadena Pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ IDNº: 15, y

ii) una Región Variable de la Cadena Ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ IDNº: 12.

Anticuerpo humanizado La presente invención se refiere a anticuerpos y composiciones para el tratamiento de la amiloidosis, un grupo de trastornos y anormalidades asociadas a la proteína amiloide, tales como la enfermedad de Alzheimer.

La amiloidosis no es una única entidad patológica, sino un grupo diverso de procesos patológicos progresivos caracterizados por depósitos de tejido extracelular de una proteína cerosa, similar al almidón, denominada amiloide, que se acumula en uno o más órganos o aparatos del cuerpo. A medida que se acumulan los depósitos de amiloide, comienzan a interferir con la función normal del órgano o aparato del cuerpo. Hay al menos 15 tipos diferentes de amiloidosis. Las formas principales son la amiloidosis primaria sin antecedentes conocidos, la amiloidosis secundaria tras alguna otra afección, y la amiloidosis hereditaria.

La amiloidosis secundaria se da durante una infección crónica o enfermedad inflamatoria, tal como tuberculosis, una infección bacteriana denominada fiebre mediterránea familiar, infecciones óseas (osteomielitis) , artritis reumatoide, inflamación del intestino delgado (ileítis granulomatosa) , enfermedad de Hodgkin, y lepra.

Los depósitos de amiloide incluyen el componente amiloide P (pentagonal) (AP) , una glicoproteína relacionada con el amiloide P sérico (SAP) normal, y los glicosaminoglicanos (GAG) sulfatados, carbohidratos complejos del tejido conectivo. Las fibrillas de proteína amiloide, que representan alrededor del 90% del material amiloide, comprenden uno de varios tipos diferentes de proteínas. Estas proteínas son capaces de plegarse en las denominadas fibrillas de láminas "plegadas beta", una configuración proteica única que exhibe sitios de unión para el rojo Congo que da como resultado las propiedades de tinción únicas de la proteína amiloide.

Muchas enfermedades asociadas al envejecimiento se basan o están asociadas a proteínas similares al amiloide y se caracterizan, en parte, por la acumulación de depósitos extracelulares de amiloide o material similar al amiloide que contribuyen a la patogénesis, así como a la progresión de la enfermedad. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, trastornos neurológicos tales como la Enfermedad de Alzheimer (EA) , demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo Dutch) ; el complejo Parkinson-Demencia de Guam. Otras enfermedades que se basan o están asociadas a proteínas similares a amiloide son la parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, ELA (esclerosis lateral amiotrófica) , diabetes del adulto; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y otros, lo que incluye la degeneración macular.

Aunque la patogénesis de estas enfermedades puede ser diversa, sus depósitos característicos contienen a menudo muchos constituyentes moleculares compartidos. Hasta un grado significativo, esto puede ser atribuible a la activación local de rutas pro-inflamatorias, que conducen así al depósito concurrente de componentes del complemento activados, reactivos de fase aguda, moduladores inmunitarios, y otros mediadores inflamatorios (McGeer et al., 1994) .

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurológico que se cree que está provocado principalmente por placas de amiloide, una acumulación de un depósito anormal de proteínas en el cerebro. El tipo más frecuente de amiloide hallado en el cerebro de los individuos afectados está compuesto principalmente de fibrillas de Aβ. Las pruebas científicas demuestran que un incremento de la producción y acumulación de la proteína beta-amiloide en placas conduce a la muerte de las neuronas, lo que contribuye al desarrollo y la progresión de EA. La pérdida de neuronas en áreas estratégicas del cerebro, a su vez, provoca la reducción de los neurotransmisores y el deterioro de la memoria. Las proteínas principalmente responsables de la acumulación de la placa incluyen la proteína precursora de amiloide (APP) y dos presenilinas (presenilina I y presenilina II) . La escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) , que se expresa de manera constitutiva y se cataboliza en la mayoría de las células, por las enzimas β y γ secretasa conduce a la liberación de un péptido Aβ de 39 a 43 aminoácidos. La degradación de APPs incrementa probablemente su propensión a agregarse en placas. El fragmento Aβ (1-42) es el que tiene especialmente una propensión elevada a construir agregados debido a dos residuos de aminoácidos muy hidrófobos en su extremo C-terminal. Se cree, por lo tanto, que el fragmento Aβ (1-42) está implicado y es responsable principalmente del inicio de la formación de placas neuríticas en EA y tiene, por lo tanto, un potencial patológico elevado. Por lo tanto, existe la necesidad de agentes para prevenir la formación de placas de amiloide y para difundir las placas existentes en EA.

Los síntomas de EA se manifiestan lentamente, y el primer síntoma puede ser solamente una falta de memoria leve. En esta etapa, los individuos pueden olvidar sucesos recientes, actividades, los nombres de personas o cosas familiares y pueden no ser capaces de resolver problemas matemáticos simples. A medida que la enfermedad progresa, los síntomas se notan más fácilmente y pasan a ser lo suficientemente graves como para provocar que las personas con EA o los miembros de sus familias busquen ayuda médica. Los síntomas de la fase intermedia de EA incluyen el olvidar cómo hacer tareas simples tales como el aseo personal, y se desarrollan problemas con el habla, la comprensión, la lectura, o la escritura. Los pacientes de EA en la fase avanzada pueden volverse nerviosos o agresivos, pueden deambular lejos de su domicilio, y finalmente necesitan asistencia completa.

En la actualidad, la única manera definitiva de diagnosticar la EA es identificar las placas y ovillos en el tejido cerebral en una autopsia tras la muerte del individuo. Por lo tanto, los médicos solamente pueden hacer un diagnóstico de EA "posible" o "probable" mientras la persona todavía está viva. Mediante el uso de los métodos actuales, los médicos pueden diagnosticar la EA correctamente hasta en un 90 por ciento de las veces mediante el uso de varias herramientas para diagnosticar una EA "probable". Los médicos hacen preguntas sobre la salud general de la persona, los problemas médicos pasados, y el historial de cualquier dificultad que la persona tenga al llevar a cabo sus actividades diarias. Los ensayos conductuales de memoria, resolución de problemas, atención, cálculo, y lenguaje proporcionan información sobre la degeneración cognitiva, y los ensayos médicos tales como análisis de sangre, orina, o líquido cefalorraquídeo, y los escáneres cerebrales pueden proporcionar cierta información adicional.

El tratamiento de EA consiste en tratamientos basados en medicación y no basados en medicación. Los tratamientos dirigidos a cambiar el desarrollo subyacente de la enfermedad (retrasar o invertir la progresión) hasta ahora han sido infructuosos en gran medida. Se ha demostrado que los medicamentos que restablecen el déficit (defecto) , o mal funcionamiento, de los mensajeros químicos de las neuronas (neurotransmisores) , en particular los inhibidores de colinesterasa (ChEIs) , tales como tacrina y rivastigmina, mejoran los síntomas. Los ChEIs impiden la degradación enzimática de los neurotransmisores, por lo que se incrementa la cantidad de mensajeros químicos disponibles para transmitir las señales nerviosas en el cerebro.

Para algunas personas en las fases temprana e intermedia de la enfermedad, los fármacos tacrina (COGNEX®, Morris Plains, NJ) , donepezilo (ARICEPT®, Tokio, JP) , rivastigmina (EXELON®, East Hanover, NJ) , o galantamina (REMINYL®, New Brunswick, NJ) pueden ayudar a prevenir que algunos síntomas empeoren durante un tiempo limitado. Otro fármaco, memantina (NAMENDA®, Nueva York, NY) , se ha aprobado para el tratamiento de EA moderada a grave. También hay disponibles medicaciones para abordar las manifestaciones psiquiátricas de EA. Además, algunos medicamentos pueden ayudar a controlar los síntomas conductuales de EA, tales como insomnio, inquietud, deambulación, ansiedad, y depresión. El tratamiento de estos síntomas a menudo hace que los pacientes estén más cómodos, y hace que su cuidado sea más sencillo para los cuidadores. Desafortunadamente, a pesar de los avances significativos en el tratamiento que demuestran que esta clase de agentes es sistemáticamente mejor que un placebo, la enfermedad continúa progresando, y el efecto medio sobre la función mental ha sido solamente modesto. Muchos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que reconoce y se une a la proteína β-amiloide, en el que dicho anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende:

i) una Región Variable de la Cadena Pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, y ii) una Región Variable de la Cadena Ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12.

2. El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según la reivindicación 1, que comprende:

una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13.

3. El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según la reivindicación 2, en el que se ha eliminado la Lys Cterminal de la región constante de la cadena pesada.

4. El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según la reivindicación 1, cuyo anticuerpo humanizado o fragmento del mismo es del isotipo IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4.

5. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5 que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº: 22 o la secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº: 21.

7. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5 que comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº: 25 o la secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº: 24.

8. Un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

9. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y que opcionalmente comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, que opcionalmente comprende además uno o más de lo siguiente: una sustancia biológicamente activa, un diluyente, o un excipiente.

12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende además una sustancia biológicamente activa que es un compuesto usado en el tratamiento de la amiloidosis.

13. La composición farmacéutica según la reivindicación 11 que comprende al menos uno de los compuestos siguientes: un compuesto anti-estrés oxidativo; un compuesto anti-apoptótico; un agente quelante de metales; un inhibidor de la reparación del ADN tal como pirenzepina y metabolitos; ácido 3-amino-1-propanosulfónico (3 APS) ; 1, 3-propanodisulfonato (1, 3PDS) ; activador de α-secretasa; inhibidor de Aβ-secretasa; un inhibidor de γ-secretasa; una proteína tau; un neurotransmisor; un agente de ruptura de láminas β; un agente atractor para componentes celulares de eliminación / disminución de amiloide beta; un inhibidor del amiloide beta truncado en posición Nterminal, tal como amiloide beta 3-42-piroglutamato; una molécula anti-inflamatoria; o un inhibidor de colinesterasa (ChEI) tal como tacrina, rivastigmina, donepezilo, y/o galantamina; un agonista MI; u otro fármaco tal como un fármaco modificador de amiloide o tau o suplemento nutritivo.

14. El uso del anticuerpo humanizado o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y/o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la preparación de un medicamento para tratar o aliviar los efectos de la amiloidosis, tal como amiloidosis secundaria, amiloidosis relacionada con la edad, trastornos neurológicos tales como la Enfermedad de Alzheimer (EA) , demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo Dutch) ; el complejo Parkinson-Demencia de Guam; enfermedades basadas o asociadas a proteínas similares a amiloide, tales como parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, ELA (esclerosis lateral amiotrófica) , diabetes del adulto; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y degeneración macular.

15. El uso según la reivindicación 14, en el que el tratamiento del animal, tal como el mamífero o ser humano,

conduce a uno o más de lo siguiente:

i) un incremento de la capacidad de la memoria cognitiva; ii) la retención de la capacidad de la memoria cognitiva; y/o iii) un restablecimiento completo de la capacidad de la memoria cognitiva.

16. La composición farmacéutica según la reivindicación 10 ó 13, para el uso en un método para prevenir, tratar o aliviar los efectos de la amiloidosis, tal como amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad, tales como enfermedades que incluyen, pero sin limitación, trastornos neurológicos tales como la Enfermedad de Alzheimer (EA) , demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo Dutch) , el complejo Parkinson-Demencia de Guam, enfermedades que se basan o están asociadas a proteínas similares a amiloide tales como parálisis supranuclear progresiva, y esclerosis múltiple, enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, ELA (esclerosis lateral amiotrófica) , diabetes del adulto, amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos, y degeneración macular.

17. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 16, en la que el tratamiento del animal, tal como el mamífero o ser humano, conduce a:

i) un incremento de la capacidad de la memoria cognitiva, ii) la retención de la capacidad de la memoria cognitiva, y/o iii) una inversión de la capacidad de la memoria cognitiva y un restablecimiento completo de la capacidad de la memoria cognitiva.

18. Un método para determinar el grado de carga de placa amiloidogénica en una muestra de tejido y/o muestra de fluido corporal, que comprende:

a) ensayar en una muestra de tejido o muestra de fluido corporal la presencia de proteína amiloide con el anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4; b) determinar la cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a la proteína; y c) calcular la carga de placa en la muestra de tejido o de fluido corporal.

19. Un equipo para la detección y el diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas a amiloide que comprende, en uno o más recipientes, el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un reactivo de detección, e instrucciones para el uso de los anticuerpos.

20. El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el uso en la desagregación de fibras hasta formas poliméricas y monoméricas solubles.

21. Un método in vitro para desagregar fibras de beta-amiloide preformadas, que comprende poner en contacto el anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3 con fibras de beta-amiloide preformadas.

22. El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, cuyo anticuerpo

o fragmento del mismo es para el uso en la protección de las neuronas de la degradación inducida por Aβ.

23. El uso del anticuerpo humanizado o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de un medicamento para prevenir la degeneración de neuronas tras la exposición al oligómero de Aβ.

C: Anticuerpo hC2 A: Anticuerpo quimérico Paciente de control

Región I del neocórtex CA4 (región 4 del hipocampo) ,

temporaI, 40 x 40 x

Paciente de EA

Región I del neocórtex Región I del neocórtex

temporaI, 40 x temporaI, 40 x

Paciente pre-EA

Región I del neocórtex Región I del neocórtex

temporaI, 40 x temporaI, 40 x

Espectro medido Suma de ajustes Espectro medido Ajuste de Val Cβ-lámina Suma de ajustes Ajuste de Val Cβ-aleatorio Ajuste de Val Cβ-lámina Ajuste de Val Cβ-aleatorio Desplazamiento químico de 13C (ppm) Desplazamiento químico de 13C (ppm)

C2 de ratón

Resonancia % de intens. % de intensidad

integral integral

Val Cβ - lámina

Val Cβ - aleatorio

A) Comparación de espectros de 13C CPMAS y ajustes para fibras de amiloide β1-42 marcadas con U13C Tyr10 y Val12 incubadas con PBS (izquierda; sirvió como control) o ACI-7-C2 (derecha) durante 24 hrs y después liofilizadas. Los ajustes para las dos conformaciones de Val12 Cβ se muestran en verde (lámina) y azul (cadena aleatoria) . El máximo en c33 ppm corresponde a la conformación de lámina beta de las fibras, mientras el de 30 ppm es el resultado de la conformación de cadena aleatoria.

B) : Comparación de los parámetros ajustados para las dos conformaciones de Val 12 Cβ. Los desplazamientos químicos ajustados para las dos conformaciones son bastante similares, pero las intensidades integrales son muy diferentes, lo que refleja una reducción de la conformación de lámina beta original en aprox. un 35% (1- (53, 5/81, 7) ) . Esto está de acuerdo con el valor obtenido de la medida de fluorescencia.

Afinidad de unión de C2 humanizado en ELISA

D.O.

preparación de amiloide betapolimérico soluble preparación de sedimento preparación de sobrenadante D.O.

Cartografía de epítopos hC2_NC_20060505

Antic. De contr.

Número de péptido Figura 1. hC2 se une a los péptidos 12, 13, 14, 15 y 16 de la biblioteca de péptidos Aβ1-42. La unión de hC2 a péptidos soapantes de Aβ1-42 se analizó mediante ELISA. La unión a Aβ1-42 completo y la unión de un anticuerpo quimérico sin unión (anticuerpo de control) se usó como controles positivos y negativos, respectivamente. El número de péptido corresponde al aminoácido de la secuencia de Aβ1-42 en el que comienza el péptido. Los resultados se expresan como D.O.

Cartografía de epítopos hC2_NC_20060519

D.O.

Péptido Figura 2. La unión de hC2 a Aβ 12-20 es completamente dependiente de los aa 16, 17, 19 y 20 y parcialmente dependiente de los aa 14, 15 y 18. La unión de hC2 a Aβ 12-20 y Aβ 12-20 con alaninas susituidas se analizó mediante ELISA. La unión al Aβ 1-42 completo se usó como control positivo. El número corresponde al aa que está sustituido por alanina. Los resultados se expresan como D.O.

Cartografía de epítopos hC2_NC_20060925-26

D.O.

Número de péptido Figura 3. La unión de hC2 a Aβ 15-23 es dependiente del aa 23 y parcialmente del aa 21 y ligeramente dependiente del aa 22. La unión de hC2 a Aβ 13-21, 14-22 o 15-23 y a 13-21G21, 14-22A22 o 15-23A23 se analizó mediante ELISA. La unión al Aβ 1-42 completo se usó como control positivo. Los resultados se expresan como D.O.