Anticuerpos que reconocen fosfo-Tau.

Un anticuerpo o parte funcional de éste que se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamíferos,

en el que dicho anticuerpo o parte funcional de éste tiene una alta afinidad de unión para proteína Tau soluble e insoluble, y modula los niveles de Tau soluble e insoluble, en el que el fosfo-epítopo es los aminoácidos 405-411 ó 405-412 que tienen una Ser fosforilada en la posición 409 (pS409), y en el que el anticuerpo o parte funcional de éste se une a la proteína Tau de mamíferos con una constante de disociación de menos de 10 nM según se mide por resonancia de plasmón superficial, en el que el anticuerpo o parte funcional de éste no se une al epítopo no fosforilado correspondiente.

Anticuerpos que reconocen fosfo-tau La presente invención se refiere a un anticuerpo o parte funcional de éste que se une específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamíferos como se define en la reivindicación 1. La invención se refiere además a aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de dicho anticuerpo o parte funcional.

Los ovillos neurofibrilares y fibrillas de neuropilema (NT) son los distintivos neuropatológicos principales de la Enfermedad de Alzheimer (AD) . Están compuestos por la proteína asociada a microtúbulos tau que ha experimentado modificaciones posteriores a la traducción, incluyendo fosforilación, desamidación e isomerización en residuos de asparaginilo o aspartilo. Se originan por la agregación de proteína tau hiper-fosforilada y sus confórmeros. AD comparte esta patología con muchas tauopatías neurodegenerativas, en particular con tipos especificados de demencia frontotemporal (FTD) .

La proteína Tau es una proteína fácilmente soluble, "naturalmente no plegada" que se une con avidez a los microtúbulos (MT) para estimular su ensamblaje y estabilidad. Los MT tienen una gran importancia para la integridad del citoesqueleto de las neuronas -y de esta manera para la formación y funcionamiento apropiados de los circuitos neuronales, por lo tanto para el aprendizaje y la memoria. La unión de tau a MT está controlada por fosforilación y desfosforilación dinámicas, como se demuestra principalmente in vitro y en células no neuronales. Debido al gran número de sitios de fosforilación posibles (>80) , la contribución exacta de cada uno y la identidad de las quinasas responsables permanece en gran medida sin identificar in vivo.

En el cerebro de AD, la patología tau se desarrolla después de, y por lo tanto probablemente en respuesta a, la patología amiloide, lo que constituye la esencia de la hipótesis de la cascada amiloide. Esto se basa en y está indicado por estudios en pacientes con AD y síndrome de Down, y está corroborado por estudios en ratones transgénicos con patología amiloide y tau combinada (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008) .

El esquema de tiempo exacto de ambas patologías en los pacientes humanos con AD así como los mecanismos que ligan la patología amiloide a tau permanecen en gran medida desconocidos, pero se propone que implican la activación de rutas de señalización neuronales que actúan en o por GSK3 y cdk5 como las "quinasas tau" principales (revisado por Muyllaert et al, 2006, 2008) .

La hipótesis de que la tauopatía no es un efecto secundario inocente sino un ejecutor patológico principal en AD se basa en observaciones genéticas, patológicas y experimentales sólidas que se corroboran entre sí completamente:

 en casos de AD familiar de inicio temprano que se deben a mutaciones en el precursor de la proteína amiloide (APP) o presenilina, la causa patogénica obligada es la acumulación amiloide, pero invariablemente la patología comprende tauopatía colateral, idéntica a la de los casos de AD esporádica de inicio tardío;

 la gravedad de la disfunción cognitiva y la demencia se correlaciona con tauopatía, no con patología amiloide, ejemplificado lo más recientemente por varios estudios de fase clínica -1 y 2 que incluyen formación de imágenes PIB-PET para amiloide e identifican muchos "falsos positivos": individuos normales cognitivamente con alta carga amiloide cerebral;

 en FTD familiar, la tauopatía está provocada por tau mutante y causa neurodegeneración directamente, sin patología amiloide;

 en modelos experimentales en ratón, los defectos cognitivos causados por patología amiloide se alivian casi completamente por la ausencia de proteína tau (Roberson et al, 2007) .

Los argumentos combinados apoyan la hipótesis de que la proteína tau es un jugador principal en la muerte cognitiva en AD y tauopatías neurodegenerativas relacionadas.

Un tratamiento emergente prominente de AD es por inmunoterapia pasiva con mAb específicos, para aclarar los péptidos amiloides y sus agregados que se presume son neuro-tóxicos o sinapto-tóxicos.

La inmunoterapia dirigida a la patología tau, como se propone aquí, se anticipa que contrarresta los confórmeros de la proteína tau patológicos que se sabe o se postula que causan disfunción sináptica y neurodegeneración. La patología amiloide causada y los agregados intra-neuronales de proteína tau hiper-fosforilada se propone que actúan sinérgicamente en la cascada cognitiva y degenerativa de eventos patológicos que dan lugar de alteración cognitiva suave (MCI) a demencia grave de AD. La combinación de la medicación dirigida a tau con medicación dirigida a amiloide (o cualquier otra) constituirá por lo tanto el tratamiento preferido y, sustancialmente más eficaz, de AD, en lugar de la mono-terapia actual.

Otras estrategias terapéuticas que están dirigidas a la proteína tau son escasas y principalmente comprenden:

 inhibidores de las quinasas que se piensa incrementan la fosforilación de tau hasta niveles patológicos  compuestos que bloquean la agregación citoplásmica de proteína tau hiper-fosforilada.

Estas estrategias presentan varios inconvenientes de especificidad y eficacia, un problema que comparten con intentos de modificar el metabolismo de APP y amiloide, todos enfatizando la importancia de una búsqueda continua de opciones de tratamiento adicionales, incluyendo inmunoterapia frente a tau.

En la práctica no se han desarrollado esfuerzos para definir -mucho menos dirigir -los confórmeros patológicos de tau in vivo. En el estudio clínico de fase II Aβ42, la patología de ovillo no parecía estar bien considerada ni analizada con mucha profundidad (Nicoll et al., 2003; Masliah et al., 2005) . Por otra parte, la inmunoterapia experimental dirigida a amiloide en un modelo preclínico de ratón con patología semejante a AD combinada demostró también un efecto en la patología tau aunque los agregados de tau persistieron (Oddo et al., 2004) .

Jicha et al (J Neuroscience, 1999, 19 (17) : 7486-7494) describe anticuerpo monoclonal PG-5, que reconoce la fosforilación dependiente de PKA de ser409 en tau. Por análisis inmunohistoquímico, se mostró que el anticuerpo PG-5 reaccionaba con la patología neurofibrilar tanto en la enfermedad de Alzheimer temprana como avanzada, pero no en tejido cerebral normal.

Se han lanzado algunas dudas sobre la factibilidad de abordar la proteína tau intra-celular por inmunoterapia. Éstas se han contrarrestado por el estudio experimental más reciente en un modelo de tauopatía en ratón (Asuni et al., 2007) . Mostraron la reducción en la patología de ovillos y mejoras funcionales por la vacunación con un fosfopéptido derivado de la proteína tau. Estos datos corroboran reportes previos de inmunoterapia dirigida a α-sinucleína en modelos de la Enfermedad de Parkinson (PD) y enfermedad de los cuerpos de Lewy (Masliah et al., 2005, 2011) y de superóxido dismutasa en un modelo de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (Urushitiani et al., 2007) . Estas enfermedades son ejemplos en los que las proteínas intra-celulares dan lugar a defectos sinápticos y neurodegeneración mediante mecanismos que todavía no se comprenden totalmente. Por otra parte, la proteína tau recombinante de longitud completa producida en y aislada de bacterias no parece adecuada como vacuna, aunque los adyuvantes usados, es decir, Freunds completo y toxina pertussis, podrían haber contribuido al resultado negativo de ese estudio Rosenmann et al., 2006) .

Existe una necesidad no cubierta de inmunoterapias pasivas y/o activas que funcionen para contrarrestar los confórmeros de la proteína patológicos que se sabe -o se presume -que causan trastornos neurodegenerativos, tales como patología amiloide en AD causada, por ejemplo, por agregados intra-neuronales de proteína tau hiperfosforilada que son tan típicos para AD como amiloide.

Esta necesidad no cubierta podría lograrse en el alcance de la presente invención proporcionando proteínas de unión que reconocen y se unen a fosfo-epítopos patológicos importantes de la proteína tau. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos específicos frente a fosfo-epítopos en la proteína tau lineales y conformacionales, simples y complejos, particularmente en la proteína tau agregada que se cree que son responsables de la sinapto-y neuro-toxicidad en las tauopatías, incluyendo AD.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere en una primera realización a un anticuerpo o parte funcional de éste que se une específicamente a un fosfo-epítopo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o parte funcional de éste que se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamíferos, en el que dicho anticuerpo o parte funcional de éste tiene una alta afinidad de unión para proteína Tau soluble e insoluble, y modula los niveles de Tau soluble e insoluble, en el que el fosfo-epítopo es los aminoácido.

40. 411 .

40. 412 que tienen una Ser fosforilada en la posición 409 (pS409) , y en el que el anticuerpo o parte funcional de éste se une a la proteína Tau de mamíferos con una constante de disociación de menos de 10 nM según se mide por resonancia de plasmón superficial, en el que el anticuerpo o parte funcional de éste no se une al epítopo no fosforilado correspondiente.

2. El anticuerpo o parte funcional de éste de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o parte funcional de éste se une al fosfo-epítopo en la proteína Tau de mamíferos con una constante de disociación de menos de 5 nM.

3. El anticuerpo o parte funcional de éste de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el anticuerpo o parte funcional de éste se une al fosfo-epítopo en la proteína Tau de mamíferos con una constante de velocidad de asociación de 104 M-1S-1 o mayor.

4. El anticuerpo o parte funcional de éste de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el anticuerpo o parte funcional de éste se une al fosfo-epítopo en la proteína Tau de mamíferos con una constante de velocidad de asociación de 105 M-1S-1 o mayor.

5. El anticuerpo o parte funcional de éste de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la Tau de mamíferos es Tau humana.

6. El anticuerpo o parte funcional de éste de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o parte funcional de éste comprende:

a) un primer dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o b) un primer dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con una secuencia de aminoácidos que es al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 27, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o c) un primer dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o d) un primer dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o e) un primer dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o f) un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7, 8, ó 9, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, ó 3; o g) un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; o h) un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; o i) un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o j) un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

7. El anticuerpo o parte funcional de éste de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado; o un anticuerpo completamente humano.

8. El anticuerpo o parte funcional de éste de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es del isotipo IgG2a, IgG2b, o IgG3.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o parte funcional de éste de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. El anticuerpo o parte funcional de éste o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en el tratamiento o alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo, en el que la enfermedad o trastorno neurodegenerativo está causado opcionalmente por o está asociado con la formación de lesiones neurofibrilares o una tauopatía.

11. El anticuerpo o parte funcional de éste o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10, en el que la administración del anticuerpo o parte funcional de éste resulta en el alivio de déficits cognitivos.

12. El anticuerpo o parte funcional de éste o la composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10 o reivindicación 11, en el que el alivio de déficits cognitivos comprende una parada de la progresión de los déficits cognitivos y/o una restauración de la capacidad de memoria cognitiva.

13. El anticuerpo o parte funcional de éste o la composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la enfermedad o trastorno neurodegenerativo se selecciona de Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilística, Síndrome de Down, enfermedad de GerstmannSträussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión, y angiopatía amiloide cerebral por proteína de prión, daño cerebral traumático y enfermedades o trastornos adicionales que no muestran una patología amiloide clara incluyendo, pero no limitado a, complejo esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuronal motora no Guamaniana con ovillos neurofibrilares, demencia con gránulos argirofílicos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia con ovillos predominantes, Parkinsonismo Postencefálico, Distrofia miotónica, y combinaciones de éstas.

14. Una línea celular que produce el anticuerpo o parte funcional de éste de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

15. La línea celular de la reivindicación 14 que es una línea celular de hibridoma seleccionada de 3A8A12G7 depositada el 25 de agosto, 2010, como DSM ACC3086; 2B6A10C11 depositada el 25 de agosto, 2010, como DSM ACC3084; 3A8E12H8 depositada el 25 de agosto, 2010, como DSM ACC3085; 2B6G7A12 depositada el 25 de agosto, 2010, como DSM ACC3087; 6H1A11C11 depositada el 25 de agosto, 2010, como DSM ACC3080; y 6H1G6E6 depositada el 25 de agosto, 2010, como DSM ACC3088.

16. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o parte funcional de éste de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

17. El anticuerpo o parte funcional de éste según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección asociado a la proteína tau, o en el diagnóstico de una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociado a la proteína tau, en un paciente que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o parte funcional de éste a un epítopo de la proteína tau in situ que incluye las etapas de

a) poner en contacto la parte del cuerpo o área del cuerpo específica que se sospecha que contiene la proteína tau con un anticuerpo o parte funcional de éste según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

b) permitir que el anticuerpo o parte funcional de éste se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico;

c) detectar la formación del complejo inmunológico.; y

d) correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la parte o área específica del cuerpo;

en el que el diagnóstico de una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociado a una proteína tau incluye además la etapa de:

e) comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor control normal, en el que un incremento en la cantidad de dicho complejo inmunológico comparado con un valor control normal indica que dicho paciente padece o presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína tau.

18. Un método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o afección asociada con la proteína tau, o para diagnosticar una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociada con la proteína tau, en un paciente que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o parte funcional de éste a un epítopo de la proteína tau en una muestra que incluye las etapas de a) poner en contacto la muestra que se sospecha que contiene la proteína tau con un anticuerpo o parte funcional de éste según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

b) permitir que el anticuerpo o parte funcional de éste se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico;

c) detectar la formación del complejo inmunológico; y

d) correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra;

en el que el diagnóstico de una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociado a una proteína tau incluye además la etapa de:

e) comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor control normal, en el que un incremento en la cantidad de dicho complejo inmunológico comparado con un valor control normal indica que dicho paciente padece o presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína tau.