Anticuerpo dirigido contra PcrV.

Un anticuerpo monoclonal, o una parte de un anticuerpo monoclonal,

contra PcrV que tiene

1) en la región variable de la cadena pesada, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen lassiguiente secuencias de aminoácidos: SETSYWMH (SEQ ID NO: 15) para CDR1, INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ IDNO: 16) para CDR2 y YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) para CDR3 y

2) en la región variable de la cadena ligera, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) para CDR1; TTSKLAS (SEQ ID NO: 19)para CDR2 y HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20) para CDR3

Anticuerpo dirigido contra PcrV

Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que reconoce PcrV, o una parte de la misma. Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene mayor actividad neutralizante (en lo sucesivo, también denominada actividad inhibidora de la citotoxicidad) que los anticuerpos anti

PcrV convencionales, o una parte de los mismos, y una composición farmacéutica que contiene los mismos.

Técnica anterior

Pseudomonas aeruginosa es un bacilo Gram-negativo aerobio obligado que existe ampliamente en el

mundo natural. Aunque su patogenicidad es normalmente baja, es un patógeno que produce infecciones oportunistas que se producen frecuentemente en pacientes que padecen diversas enfermedades preexistentes tales como cáncer y diabetes, y en pacientes administrados con productos farmacéuticos que tienen acción inmunoinhibidora, y puede frecuentemente producir neumonía, infección de las vías urinarias, septicemia y similares conduciendo a resultados graves. En campos clínicos, la infección por Pseudomonas aeruginosa se considera una de las infecciones más difíciles de tratar debido a que no solo Pseudomonas aeruginosa tiene sensibilidad inherentemente baja a antibióticos existentes, sino que también tiene alta tendencia a adquirir fácilmente resistencia a diversos antibióticos y se vuelve difícil de curar. Así, para Pseudomonas aeruginosa, la medida de desarrollar nuevos antibióticos uno tras otro está limitada, y se desea fuertemente un procedimiento terapéutico que no se base en antibióticos.

La alta citotoxicidad de Pseudomonas aeruginosa se ejerce mediante la inyección de toxina en una célula eucariota mediante un sistema de secreción de exotoxina de tipo III. PcrV es una proteína de 294 residuos (nº de acceso de NCBI AAC45935, SEQ NO: 1) que constituye el sistema de secreción de exotoxina de tipo III, y una secuencia de operón que codifica la misma está abierta al público (Documento de patente 1, Documento de no patente 1) . Como el control de PcrV puede conducir posiblemente a medios terapéuticos en infección por Pseudomonas aeruginosa (Documento de no patente 2) , se informan anticuerpos policlonales (Documentos de no patente 3, 4) y anticuerpos monoclonales (Documento de patente 2, Documentos de no patente 5, 6) contra PcrV que tienen actividad neutralizante. Sin embargo, los anticuerpos policlonales son difíciles de humanizar y de usar como composiciones farmacéuticas debido a la dificultad en mejorar la antigenicidad. Los anticuerpos monoclonales que se han informado hasta la fecha también tienen baja actividad neutralizante y fracasan en satisfacer los requisitos en campos clínicos.

Documento de patente 1: patente de EE.UU. nº 6.551.795 Documento de patente 2: traducción japonesa de la publicación PCT nº. 2005-500250

Documento de no patente 1: Yahr, T.L. y col., J. Bacteriol., 1997, vol. 179, pág. 7165 Documento de no patente 2: T. Sawa y col., Nature Medicina, 1999, vol. 5, pág. 392 Documento de no patente 3: Shime N y col., J. Immunol. 2001, vol. 167, pág. 5880 Documento de no patente 4: Imamura Y y col., Eur. Respir. J., 2007, vol. 29, pág. 965 Documento de no patente 5: Karine Faure y col., J. Immune. Based. Therapies and Vaccines, 2003, vol. 1

Documento de no patente 6: Dara W. Frank y col., J. Infect. Disease, 2002, vol. 186, pág. 64

Divulgación de la invención Problema a resolver por la invención 50 [0004] Es un objetivo de la presente invención proporcionar una medida que sea eficaz en la terapia de infección, en particular, infección por Pseudomonas aeruginosa.

Medios para resolver el problema 55 [0005] Como resultado de laboriosos esfuerzos en la preparación de anticuerpo monoclonal contra PcrV, los presentes inventores han tenido éxito en la preparación de un anticuerpo monoclonal novedoso que se considera que tiene mayor efecto terapéutico sobre la enfermedad, en comparación con un anticuerpo monoclonal anti-PcrV convencionalmente conocido, y han completado la presente invención.

Para ser más específica, la presente invención se refiere a la materia de las reivindicaciones 1-9. También se desvelan (1) un anticuerpo monoclonal contra PcrV o una parte del mismo, que tiene al menos una característica seleccionada de:

(A) inhibir el 50% o más de citotoxicidad para célula de leucocito de Pseudomonas aeruginosa a una concentración de 1 nM a 200 nM in vitro;

(B) inhibir el 50% o más de citotoxicidad para célula de mieloma de Pseudomonas aeruginosa a una concentración 10 de 1 nM a 50 nM in vitro; y

(C) tener una constante de disociación (Kd) con PcrV de 2 × 10-9 (M) o menos;

(2) un anticuerpo monoclonal o una parte del mismo, que tiene la secuencia de aminoácidos en la que la región

determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal se produjo por cualquiera del hibridoma depositado como un número de acceso de FERM BP-11085 e hibridoma depositado como un número de acceso de FERM BP-11086;

(3) un anticuerpo monoclonal o una parte del mismo, producido por cualquiera del hibridoma depositado como un 20 número de acceso de FERM BP-11085 e hibridoma depositado como un número de acceso de FERM BP-11086;

(4) un anticuerpo monoclonal contra PcrV o una parte del mismo, que tiene su epítope en las posiciones 136 a 233 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;

(5) un anticuerpo monoclonal contra PcrV o una parte del mismo, que tiene 1) en una región determinante de la complementariedad, una región variable de la cadena pesada que incluye la siguiente secuencia de aminoácidos: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) , INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) , YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) y 2) en una región determinante de la complementariedad, una región variable de la cadena ligera que incluye la siguiente secuencia de aminoácidos: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) , TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) , HQWRNYPFT

(SEQ ID NO: 20) ;

(6) un anticuerpo monoclonal contra PcrV o una parte del mismo, que tiene 1) en una región determinante de la complementariedad, una región variable de la cadena pesada que incluye la siguiente secuencia de aminoácidos: SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21) , YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) , SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23) y 2) en una región determinante de la complementariedad, una región variable de la cadena ligera que incluye la siguiente secuencia de aminoácidos: KASQYVGTTVA (SEQ ID NO: 24) , RASTRHT (SEQ ID NO: 25) , QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26) ;

(7) un anticuerpo monoclonal contra PcrV o una parte del mismo, que tiene 1) una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y 2) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

(8) un anticuerpo monoclonal contra PcrV o una parte del mismo, que tiene 1) una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y 2) una región variable de la cadena ligera que 45 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;

(9) una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o una parte del mismo según una cualquiera de (1) a (8) , como principio activo; y

(10) un hibridoma que produce el anticuerpo o una parte del mismo según una cualquiera de (1) a (8) .

Efecto de la invención [0007] Un anticuerpo monoclonal o una parte del mismo de la presente invención es útil como agente 55 terapéutico de infección debido a su muy excelente actividad neutralizante sobre PcrV.

Breve explicación de los dibujos [0008]

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra curvas en las que PcrV marcada con biotina está sustituida con PcrV no marcada en anticuerpos para PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) .

[Fig. 2] La Fig. 2 muestra afinidades de anticuerpos para PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) determinadas por análisis de resonancia de plasmones superficiales.

[Fig. 3] La Fig. 3 muestra resultados de ensayos de sándwich entre anticuerpos para PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) y Mab166.

[Fig. 4] La Fig. 4 muestra efectos inhibidores de anticuerpos para PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) sobre la citotoxicidad para células U937 de la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa.

[Fig. 5] La Fig. 5 muestra efectos inhibidores de anticuerpos para PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) sobre la 15 citotoxicidad para células de mieloma P3U1 de la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa.

[Fig. 6] La Fig. 6 muestra curvas en las que PcrV marcada con biotina está sustituida con PcrV de longitud completa no marcada y PcrV truncada en anticuerpos para PcrV (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 y Mab166) .

... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal, o una parte de un anticuerpo monoclonal, contra PcrV que tiene 1) en la región variable de la cadena pesada, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguiente secuencias de aminoácidos: SETSYWMH (SEQ ID NO: 15) para CDR1, INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) para CDR2 y YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) para CDR3 y

2) en la región variable de la cadena ligera, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) para CDR1; TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) para CDR2 y HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20) para CDR3.

2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o la parte del anticuerpo monoclonal

según la reivindicación 1, como principio activo. 15

3. El anticuerpo monoclonal o la parte del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.

4. El anticuerpo monoclonal o la parte del anticuerpo monoclonal para su uso en un procedimiento de 20 tratamiento médico según la reivindicación 3, en el que el tratamiento médico es tratar infección.

5. El anticuerpo monoclonal o la parte del anticuerpo monoclonal para su uso según la reivindicación 4, en el que la infección es infección de las vías respiratorias.

6. El anticuerpo monoclonal o la parte del anticuerpo monoclonal para su uso según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que la infección está asociada a fibrosis quística.

7. Uso del anticuerpo monoclonal o la parte del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para tratar infección. 30

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la infección es infección de las vías respiratorias.

9. Uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la infección está asociada a fibrosis

quística. 35