Antagonistas y conjugados de péptidos CGRP.

Una composición de materia que comprende:

un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7V8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20G21

V22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26F27V28p29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37 (SEO ID NO: 1130)

en la que:

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 y Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo

de aminoácido hidrófobo;

Xaa9 es un residuo de Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe;

Xaa 10 es un residuo de His, NU-metil-His, Lys, homolisina, omitina o 4-amino-Phe.

Antagonistas y conjugados de péptidos CGRP.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n° 60/729.083, presentada el 21 de octubre de 2005

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere a las técnicas bioquímicas, en particular a conjugados de péptidos terapéuticos.

2. Discusión de la técnica relacionada La superfamilia de péptidos de calcitonina (CT) incluye al menos cinco miembros conocidos: CT, amilina (AMY) , adrenomedulina (ADM) y dos péptidos relacionados con el gen de calcitonina, CGRP1 (también conocido como aCGRP) y CGRP2 (también conocido como ~CGRP) . La calcitonina está implicada en el control del metabolismo óseo y también es activa en el sistema nervioso central (SNC) . La amilina también tiene sitios de unión específicos en el SNC y se cree que regula el vaciado gástrico y tiene un papel en el metabolismo de los hidratos de carbono. La ADM es un potente vasodilatador. La ADM tiene receptores específicos en astrocitos y su ARN mensajero se regula por incremento en tejidos del SNC que se ven sometidos a isquemia. (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15) , Brain Res., 724:238-245 (1996) ; Wang et al., Discover y of adrenomedullin in rat ischaemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischaemic damage, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92: 1 1480-1 1484 (1995». Las actividades biológicas de CGRP incluyen la regulación de las uniones neuromusculares, de la presentación de antígenos dentro del sistema inmunitario, del tono vascular y de la neurotransmisión sensorial. (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992) ; Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995». Se han identificado recientemente tres péptidos estimulantes del receptor de calcitonina (CRSP) en varias especies de mamífero; los CRSP pueden formar una nueva subfamilia en la familia de CGRP, sin embargo, las formas moleculares endógenas, los receptores y la actividad biológica de los CRSP sigue sin identificarse. (Katafuchi, T y Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25 (11 ) :2039-2045 (2004».

Los péptidos de la superfamilia de CT actúan a través de receptores acoplados a proteínas G con siete dominios transmembrana (GPCR) . El receptor de CT y los receptores de CGRP son GPCR de tipo 11 ("familia B") , familia que incluye otros GPCR que reconocen péptidos reguladores tales como secretina, glucagón y polipéptido intestinal vasoactivo (VIP) . Las variantes de corte y empalme mejor caracterizadas del receptor de CT humana difieren dependiendo de la presencia (anteriormente CTRII+ o CTR1, actualmente conocida como CT (b) o ausencia (la variante de corte y empalme principal, anteriormente CTRII_ o CTR2, actualmente conocida como CT (a) de 16 aminoácidos en el primer bucle intracelular. (Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular doma in modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995) ; Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soco Trans., 32:865-867 (2004) ; Poyner et al., 2002) . Se había propuesto la existencia de al menos dos subtipos de receptores de CGRP a partir de las afinidades de antagonistas y potencias de agonistas diferenciales en una variedad de bioensayos in vivo e in vitro. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and peripher y , J. Pharmacol. Exp. Ther., 254: 123-128 (1990) ; Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for receptor multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251: 718-725 (1989) ; Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys (Et) 2, 7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997».

Se encontró que el subtipo de receptor de CGRP1 era sensible al fragmento de antagonista CGRP (8-37) . (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP- (8-37) , Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989) ; Dennis et al. (1990) ; Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and peripher y , J Pharmacol. Exp. Ther., 258: 1084-1090 (1991». En cambio, el receptor de CGRP2 era sensible a análogos de CGRP humano lineales (hCGRP) , en los que los residuos de cisteína en las posiciones 2 y 7 se derivatizaron (por ejemplo, con acetoaminometilo [Cys (ACM) 2, 7] o etilamida [CYS (Et) 2, 7]) , pero el receptor de CGRP2 era insensible al fragmento CGRP (8-37) . (Dennis et al. (1989) ; Dennis et al. (1990) ; Dumont et al. (1997». En 1998, se identificó el receptor de CGRP1 como un heterodímero compuesto por una proteína accesoria de dominio transmembrana único novedosa, una proteína 1 modificadora de la actividad de receptores (RAMP1) Y un receptor de tipo receptor de calcitonina (CRLR o "CL") . (McLatchie et al., RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333-339 (1998».

CRLR tiene una identidad de secuencia de aminoácidos global del 55% con el receptor de CT, aunque los dominios transmembrana son casi el 80% idénticos. (McLatchie et al. (1998) ; Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002) ) .

La especificidad de ligando del receptor de CT y CRLR depende de la coexpresión de miembros de una familia de proteínas accesorias denominadas proteínas modificadoras de la actividad de receptores (RAMP) . La familia de RAMP incluye tres que actúan como moduladores de receptores que determinan la especificidad de ligando de receptores para los miembros de la familia de CT. Las RAMP son proteínas transmembrana de tipo I que comparten una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 30% y una topología pronosticada común, con extremos C-terminales citoplasmáticos cortos, un dominio transmembrana y extremos N-terminales extracelulares grandes que son responsables de la especificidad. (McLatchie et al. (1998) ; Fraser et al., The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55: 1054-1059 (1999) ) .

Se ha mostrado que CRLR forma un receptor de alta afinidad para CGRP, cuando se asocia con RAMP1, o que se une preferentemente a ADM cuando se asocia con RAMP2 o RAMP3. (McLatchie et al. (1998) ; Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:73-83 (2001) ; Conner et al., Interaction of calcitonin-generelated peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30 (parte 4) : 451-454 (2002) ) . El estado de glicosilación de CRLR está asociado con su farmacología. RAMP 1, 2 Y 3 transportan CRLR a la membrana plasmática con eficacias similares, sin embargo RAMP1 presenta CRLR como una glicoproteína madura, glicosilada de manera terminal y un receptor de CGRP, mientras que RAMP 2 Y 3 presentan CRLR como un receptor de ADM glicosilado en el centro, inmaduro. (Fraser et al. (1999) ) . La caracterización de los receptores CRLR/RAMP2 y CRLR/RAMP3 en células HEK293T mediante unión a radioligando C251-ADM como radioligando) , ensayo funcional (medición de AMPc) o análisis bioquímico (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida) reveló que eran indistinguibles, aún cuando RAMP 2 Y 3 comparten una identidad de secuencia de aminoácidos de sólo el 30%. (Fraser et al. 1999) ) .

Se han observado diferencias, sin embargo, en la farmacología para CRLR expresado con RAMP 2 frente a RAMP 3. Tanto aCGRP como CGRP8-37 así como ADM y ADM 22-52 son activos en el heterodímero de RAMP 3, lo que indica que este complejo puede actuar como tanto un CGRP como un receptor de ADM. (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003) ; Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003) ) . La coexpresión de CRLR humano con RAMP1 de rata, y viceversa, mostró que la especie RAMP1 determinaba las características farmacológicas... [Seguir leyendo]

1. Una composición de materia que comprende: un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7V8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20G21 V22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26F27V28p29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37 (SEO ID NO: 1130)

en la que:

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 y Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo; Xaa9 es un residuo de Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe;

Xaa10 es un residuo de His, NU-metil-His, Lys, homolisina, omitina o 4-amino-Phe;

Xaa11 es un residuo de NU-metil-Arg, homoarginina, Cit, W-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

Xaa12 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa13 es Ala, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa14 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa15 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa16 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa17 es Ser, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa18 es un residuo de NU-metil-Arg, homoarginina, Cit, NU-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

Xaa19 es Ser, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa20 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa23 es un residuo de Val, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Om, Dab, Dpr, homocisteína o 4-amino-Phe;

Xaa24 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

Xaa25 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

Xaa26 es un residuo de Asn, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4-amino-Phe;

Xaa30 es un residuo de Thr, NU-metil-Thr, Ser o NU-metil-Ser;

Xaa31 es un residuo de Asn, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido betaglutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa34 es un residuo de Oic, Pro, Hyp, Tic, D-Tic, D-Pro, Thz, Aib, Sar o Pip; Xaa35 es un residuo de Phe, D-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp o Bip;

Xaa36 es Ala, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp; y

Xaa37 es un residuo de Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp, Bip, 4-carboxi-fenilalanina o 4-amino-Phe; y

en la que un primer par de residuos de aminoácido seleccionados de Xaa7, Xaas, Xaa9, Xaa1O, Xaa11 , Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa1S, Xaa19, Xaa20, Xaa30, Xaa31 , Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35 , Xaa36 y Xaa37 se unen covalentemente para formar un primer anillo y el primer par de residuos de aminoácido que forman el primer anillo están separados por de 3 a 7 residuos de aminoácido en la secuencia primaria del péptido CGRP; y

en la que el resto carboxilo C-terminal se reemplaza por un resto seleccionado de

(A) - C (=O) NRR, en el que R es independientemente hidrógeno, alquilo (C, -Cs) , haloalquilo, arilo o heteroarilo; y

(B) - CH20R en el que R es H, alquilo (C1-CS) , arilo o heteroarilo; y

en la que se conjuga un vehículo farmacéuticamente aceptable con el péptido CGRP en un sitio distinto de en el residuo de aminoácido C-terminal del péptido.

2. Una composición de materia que comprende:

un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

Xaa 1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7VSXaa9Xaa 10Xaa11 L12A13G14L15L16S17Xaa1SS19G20G21V22Xaa23Xaa24Xaa25 Xaa26F27V2Sp29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35A36Xaa37 (SEO ID NO: 1127) en la que:

-Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, xa"J>";¡Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo;

Xaa9 es un residuo de Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe;

Xaa10 es un residuo de His, NCX-metil-His, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

Xaa11 es un residuo de NCX-metil-Arg, homoarginina, Cit, NCX-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

Xaa1S es un residuo de NCX-metil-Arg, homoarginina, Cit, NCX-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

Xaa23 es un residuo de Val, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4-amino-Phe;

Xaa24 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

Xaa25 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

Xaa26 es un residuo de Asn, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4-amino-Phe;

Xaa30 es un residuo de Thr, NCX-metil-Thr, Ser o NCX-metil-Ser;

Xaa31 es un residuo de Asn, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido betaglutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa34 es un residuo de Oic, Pro, Hyp, Tic, D-Tic, D-Pro, Thz, Aib, Sar o Pip;

Xaa35 es un residuo de Phe, D-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp o Bip;

Xaa37 es un residuo de Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp o Bip; y

en la que el resto carboxilo C-terminal se reemplaza por un resto seleccionado de

(A) - C (=O) NRR, en el que R es independientemente hidrógeno, alquilo (C1-Cs) , haloalquilo, arilo o heteroarilo; y

(B) - CH20R en el que R es H, alquilo (C1-CS) , arilo o heteroarilo; y

3.

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5.

6.

7."

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13.

en la que se conjuga un vehículo farmacéuticamente aceptable con el péptido CGRP en un sitio distinto del en el residuo de aminoácido C-terminal del péptido.

La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que Xaa7 se selecciona de Trp, 1-Nal, 2-Nal" Phe, Tyr o Sipo La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido CGRP comprende en su extremo N-terminal un resto acilo, acetilo, benzoílo, benciloxicarbonilo, bencilo o dibencilo.

La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el vehículo se conjuga con el péptido CGRP en la posición de aminoácido 23, la posición 24 o la posición 25, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa (SEO ID NO:43) .

La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un polietilenglicol, un copolímero de etilenglicol, un polipropilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1, 3-dioxolano, un poli-1 , 3, 6-trioxano, un copolímero de etileno/anhídrido maleico, un poliaminoácido, una dextrano-n-vinilpirrolidona, una poli-n-vinilpirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un poli (alcohol vinílico) , una cadena gilcosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga, un dominio Fe de inmunoglobulina, una albúmina, una transtiretina, una globulina de unión a tiroxina o un ligando que tiene afinidad por una proteína plasmática de semivida larga, seleccionándose dicho ligando de ligandos peptídicos y ligandos de molécula pequeña; o una combinación de cualquiera de estos miembros.

La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido CGRP comprende además un marcador isotópico. -, .

La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido de CGRP se conjuga con un polietilenglicol (PEG) en:

(a) 1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizac;los con amino del PEG;

(b) 1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con tiol del PEG;

(c) 1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;

(d) 1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;

(e) 1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG; o

(f) 1, 2, 3 ó 4 sitios funcional izados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG.

La composición de materia de la reivindicación 1, en la que un segundo par de residuos de aminoácido, ambos miembros del cual son diferentes de ambos miembros del primer par de residuos de aminoácido, se selecciona de Xaa7, Xaa8, Xaa9 Xaa1O, Xaa11 , Xaa12 , Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa18, Xaa19, Xaa20, Xaa30, Xaa31 , Xaa32, Xaa33, Xaa34 , Xaa35, Xaa36 y Xaa37, uniéndose covalentemente el segundo par de residuos de aminoácido para formar un segundo anillo, en la que el segundo par de residuos de aminoácido que forman el segundo anillo están separados por de 3 a 7 residuos de aminoácido en la secuencia primaria del péptido CGRP, y en la que ambos miembros del segundo par de residuos de aminoácido están más próximos en la secuencia primaria a o bien el extremo C-terminal o bien el extremo N-terminal del péptido CGRP en comparación con ambos miembros del primer par de residuos de aminoácido.

La composición de materia de la reivindicación 2, que comprende un péptido CGRP que comprende una secuencia primaria de aminoácidos de SEO ID NO: 658.

Una composición farmacéutica que comprende la composición de materia de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 Yun portador farmacéuticamente aceptable.

La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento de la migraña.

La composición de materia de las reivindicaciones 1-10, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un polialquilenglicol.

FIG.1

Estructura de aCGRP humano Los residuos sombreados se han implicado en la unión al receptor.

1. 7 &-1.

2. 37 activación del receptor unión al receptor región de bisagra unión, al receptor ACDTATC VT~GLL~ SGGVVKNNFV ~CONH21 I (l. hélice giro giro giro

disulfuro FIG.2

M8

M2----------------~

¡-=....

KN

M7 Ae -ilVT!fAGL _ _E'_V_P_T_D P_F_A_F_-_N_H_2_ M1

1º. .__ __

M6

M\;3 ____--'

FIG.3

Lys-Glu o ("'/'N~

~ H ..., ...

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Control M.oH al 21'11

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