Antagonistas de activina-ActRlla y usos para promover el crecimiento óseo.

Un polipéptido ActRIIa de unión a activina que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95%idéntica a SEC.

ID Nº: 7, en la cual el extremo N-terminal es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11).

Antagonistas de activina-ActRIIa y usos para promover el crecimiento óseo Antecedentes de la invención Los trastornos óseos, que abarcan desde osteoporosis hasta fracturas, representan una serie de estados patológicos para los cuales existen pocos agentes farmacéuticos eficaces. En lugar de ello, el tratamiento se enfoca en intervenciones físicas y conductuales, que incluyen inmovilización, ejercicio y cambios de dieta. Sería beneficioso contar con agentes terapéuticos que promovieran el crecimiento óseo y el aumento de la densidad ósea con el propósito de tratar diversos trastornos óseos.

El crecimiento y la mineralización de los huesos dependen de las actividades de dos tipos de células, los osteoblastos y los osteoclastos, aunque los condrocitos y las células de la vasculatura también participan en aspectos críticos de estos procesos. Embriológicamente, la formación de hueso se produce a través de dos mecanismos, la osificación endocondral y la osificación intramembranosa, siendo la primera responsable de la formación de hueso longitudinal y la última responsable de la formación de huesos topológicamente planos, como los huesos del cráneo. La osificación endocondral requiere la formación y degradación secuenciales de las estructuras cartilaginosas de las placas de crecimiento que sirven como moldes para la formación de osteoblastos, osteoclastos, la vasculatura y la mineralización subsiguiente. Durante la osificación intramembranosa, se forma hueso directamente en los tejidos conectivos. Ambos procesos requieren la infiltración de osteoblastos y la sedimentación posterior en la matriz.

Las fracturas y otras alteraciones estructurales del hueso cicatrizan a través de un proceso que, al menos superficialmente, se asemeja a la secuencia de los sucesos del desarrollo de la osteogénesis, que incluyen la formación de tejido cartilaginoso y la mineralización subsiguiente. El proceso de cicatrización de la fractura se puede producir de dos maneras. La cicatrización ósea directa o primaria ocurre sin formación de callo. La cicatrización ósea indirecta o secundaria se produce con una etapa precursora de callo. La cicatrización primaria de fracturas implica que se vuelva a formar la continuidad mecánica a través de una ruptura localizada en una zona. En condiciones adecuadas, los osteoclastos que rodean la ruptura muestran una respuesta resortiva con tunelización y establecen vías para la penetración de los vasos sanguíneos y la cicatrización posterior. La cicatrización secundaria de los huesos sigue un proceso de inflamación, formación de un callo blando, mineralización del callo y remodelación del callo. En la etapa de inflamación, se producen un hematoma y una hemorragia como consecuencia de la ruptura de los vasos sanguíneos periósticos y endósticos en el sitio de la lesión. Las células inflamatorias invaden la zona. En la etapa de formación del callo blando, las células producen nuevos vasos, fibroblastos, material intracelular y células de soporte, que forman tejido de granulación en el espacio entre los fragmentos de la fractura. La unión clínica a través de la ruptura es establecida por tejido fibroso o cartilaginoso (callo blando) . Se forman osteoblastos que actúan de mediadores en la mineralización del callo blando, que después es reemplazado por hueso laminar y sometido a los procesos de remodelación normales.

Además de las fracturas y otras rupturas físicas de la estructura del hueso, la pérdida del contenido mineral del hueso y de la masa ósea puede ser causada por una amplia variedad de condiciones y puede ocasionar problemas médicos importantes. Los cambios en la masa ósea ocurren de manera relativamente predecible a lo largo de la vida de un individuo. Hasta alrededor de los 30 años de edad, los huesos de los hombres y las mujeres crecen hasta su máxima masa a través del crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondral y crecimiento radial. Después de aproximadamente los 30 años (para el hueso trabecular, por ejemplo, los huesos planos como las vértebras y la pelvis) y los 40 años (para el hueso cortical, por ejemplo, los huesos largos de las extremidades) , se produce una pérdida lenta de masa ósea en los hombres y las mujeres. En las mujeres, se produce además una fase final de pérdida importante de hueso, probablemente debido a deficiencias de estrógeno posmenopáusicas. Durante esta fase, las mujeres pueden perder un 10% adicional de masa ósea del hueso cortical y 25% del compartimiento trabecular. Que la pérdida progresiva de hueso dé como resultado una enfermedad como la osteoporosis depende en gran parte de la masa ósea inicial del individuo y de si existen condiciones exacerbantes.

La pérdida ósea se caracteriza a veces como un desequilibrio en el proceso de remodelación normal del hueso. El hueso sano está constantemente sujeto a remodelación. La remodelación comienza con la resorción ósea por los osteoclastos. El hueso resorbido es reemplazado después por tejido óseo nuevo, que se caracteriza por formación de colágeno por los osteoblastos, y la calcificación subsiguiente. En los individuos sanos, las tasas de resorción y formación están equilibradas. La osteoporosis es una afección progresiva crónica, marcada por un desplazamiento del equilibrio hacia la resorción, que da como resultado una disminución general en la masa ósea y la mineralización ósea. La osteoporosis en los seres humanos es precedida por la osteopenia clínica (densidad mineral ósea mayor que una desviación estándar pero menor que 2.5 desviaciones estándar por debajo del valor medio para el hueso de un adulto joven) . En todo el mundo, aproximadamente 75 millones de personas corren el riesgo de sufrir osteoporosis.

Con respecto a la osteoporosis, el estrógeno, la calcitonina, la osteocalcina con vitamina K, o altas dosis de calcio en la dieta todos se utilizan como intervenciones terapéuticas. Otros enfoques terapéuticos para la osteoporosis incluyen los bisfosfonatos, la hormona paratiroidea, los calcimiméticos, las estatinas, los esteroides anabólicos, las sales de lantano y estroncio, y el fluoruro de sodio. Sin embargo, dichos agentes terapéuticos, a menudo están asociados a efectos secundarios indeseables.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente divulgación el proporcionar composiciones y métodos para promover el crecimiento y la mineralización de los huesos.

Resumen de la invención En parte, la divulgación demuestra que las moléculas que tienen actividad antagonista de activina o ActRIIa (quot;antagonistas de activinaquot; y quot;antagonistas de ActRIIa quot;) se pueden utilizar para aumentar la densidad ósea, promover el crecimiento óseo y/o aumentar la resistencia ósea. En particular, la divulgación demuestra que una forma soluble de ActRIIa actúa como un inhibidor de la señalización de activina-ActRIIa y promueve el aumento de la densidad ósea, del crecimiento óseo y de la resistencia ósea in vivo. Si bien la mayoría de los agentes farmacéuticos que promueven el crecimiento óseo o inhiben la pérdida ósea actúan como agentes anticatabólicos (a los que también se hace referencia comúnmente como quot;agentes catabólicosquot;) (p. ej., bisfosfonatos) o agentes anabólicos (p. ej., hormona paratiroidea, PTH, cuando se dosifican adecuadamente) , la proteína ActRIIa soluble exhibe actividad dual, tiene a la vez efectos catabólicos y anabólicos. Por lo tanto, la divulgación establece que los antagonistas de la vía de señalización de activina-ActRIIa se pueden utilizar para aumentar la densidad ósea y promover el crecimiento óseo. Si bien la ActRIIa soluble puede afectar al hueso por un mecanismo distinto del antagonismo de activina, la divulgación demuestra no obstante que se pueden seleccionar agentes terapéuticos deseables basándose en la actividad antagonista de activina-ActRIIa. Por lo tanto, los antagonistas de activina-ActRIIa se pueden usar para tratar trastornos asociados a baja densidad ósea o baja resistencia ósea, como la osteoporosis, o para promover el crecimiento óseo en pacientes que lo necesitan, como en pacientes con una fractura de hueso. Además, el polipéptido ActRIIa soluble promueve el crecimiento óseo sin causar un aumento consecuentemente mensurable en la masa muscular.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido ActRIIa de unión a activina que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) .

El polipéptido del primer aspecto puede tener una secuencia de aminoácidos que comprenda SEC. ID Nº: 7 o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 7. Los polipéptidos ActRIIa del primer aspecto se pueden formular... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido ActRIIa de unión a activina que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la cual el extremo N-terminal es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) .

2. El polipéptido ActRIIa de unión a activina de la reivindicación 1, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº:7.

3. El polipéptido ActRIIa de unión a activina de las reivindicaciones 1 o 2, donde el polipéptido es al menos 95% puro con respecto a los contaminantes proteicos, según se determinó por cromatografía de exclusión por tamaño.

4. El polipéptido ActRIIa de unión a activina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido presenta al menos 10 veces la selectividad en la constante de disociación por activina frente a GDF-11.

5. Una preparación farmacéutica que comprende el polipéptido ActRIIa de unión a activina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. La preparación farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicha preparación es sustancialmente apirógena.

7. Un polinucleótido aislado que contiene una secuencia codificante del polipéptido ActRIIa de unión a activina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. El polinucleótido aislado de la reivindicación 7, donde el polinucleótido aislado comprende una secuencia de SEC. ID Nº: 14.

9. Un polinucleótido recombinado que comprende una secuencia promotora unida operativamente a un polinucleótido de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Una célula transformada con un polinucleótido recombinado de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

11. La célula de la reivindicación 10, donde la célula es una célula de mamífero.

12. La célula de la reivindicación 11, donde la célula es una célula CHO o una célula humana, donde la célula humana no es una célula madre embrionaria humana ni una célula germinal humana.

13. Un método para preparar un polipéptido ActRlla de unión a activina, que comprende: a) cultivar una célula en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido ActRIIa soluble, donde dicha célula es transformada con un polinucleótido recombinado de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9; y b) recuperar el polipéptido ActRIIa de unión a activina así expresado.

14. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal del polipéptido es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) , para usar en la promoción del crecimiento óseo, aumentar la densidad ósea o aumentar la resistencia ósea.

15. El polipéptido de la reivindicación 14, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº:7.

16. El polipéptido de las reivindicaciones 14 o 15, donde el polipéptido puede tener una o más de las características siguientes i) se une a un ligando de ActRIIa con una KD de al menos 10-7 M; e ii) inhibe la señalización de ActRIIa en una célula.

17. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde dicho polipéptido incluye uno o más residuos de aminoácidos modificados, seleccionados entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a una porción lipídica y un aminoácido conjugado a un agente de derivación orgánico.

18. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal del polipéptido es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) , para usar en el tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos.

19. El polipéptido de la reivindicación 18, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº:7.

20. El polipéptido de las reivindicaciones 18 o 19, donde el polipéptido puede tener una o más de las características

21. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde dicho polipéptido incluye uno o más residuos de aminoácidos modificados, seleccionados entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a una porción lipídica y un aminoácido conjugado a un agente de derivación orgánico.

22. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde el trastorno relacionado con los huesos se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis primaria y osteoporosis secundaria.

23. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde el trastorno relacionado con los huesos se selecciona del grupo que consiste en: osteoporosis post-menopáusica, pérdida ósea por hipogonadismo, pérdida de masa ósea inducida por un tumor, pérdida de masa ósea inducida por tratamiento contra el cáncer, metástasis óseas, mieloma múltiple y enfermedad de Paget.

24. Una combinación que comprende (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal del polipéptido es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) , y (b) un agente seleccionado del gurpo que consiste en: un bisfosfonato, un estrógeno, un modulador selectivo del receptor de estrógenos, una hormona paratiroidea, una calcitonina, un complemento de calcio y un complemento de vitamina D para usar en el tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos.

25. La combinación de la reivindicación 24, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº: 7.

26. Una preparación farmacéutica que comprende (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal del polipéptido es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) ; y (b) un agente seleccionado del grupo que consiste en: un bisfosfonato, un estrógeno, un modulador selectivo del receptor de estrógenos, una hormona paratiroidea, una calcitonina, un complemento de calcio y un complemento de vitamina D.

27. La preparación farmacéutica de la reivindicación 26, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº: 7.

28. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal del polipéptido es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) , para usar en el tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos.

29. El uso de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la que el extremo N-terminal del polipéptido es ILGRSETQE (SEC. ID Nº: 11) , en la fabricación de un medicamente para prevenir un trastorno relacionado con los huesos.

30. El polipéptido de la reivindicación 28 o el uso de la reivindicación 29, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº:7.

31. El polipéptido de las reivindicaciones 28 0 30 o el uso de las reivindicaciones 29 o 30, donde el trastorno relacionado con los huesos es cáncer que está asociado a metástasis óseas.

32. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 28 o 30 a 31, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde el trastorno relacionado con los huesos es pérdida ósea asociada a un régimen de tratamiento contra el cáncer.

33. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 28 o 30 a 31, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde el trastorno relacionado con los huesos es cáncer asociado a pérdida ósea.

34. El polipéptido ActRIIa de unión a activina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6 o 26 a 27, el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, 28

o 30 a 33, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 donde el polipéptido es glucosilado.

35. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, 28 o 30 a 33, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido consiste en SEC. ID Nº: 7.

36. Una proteína de fusión ActRIIa-Fc, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC. ID Nº: 7, en la cual el extremo N-terminal del polipéptido es

37. La proteína de fusión de la reivindicación 36, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEC. ID Nº: 7.

38. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 37, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc causa menos de 10% de aumento de masa del músculo esquelético en el paciente.

39. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc está destinada a ser administrada de modo de alcanzar una concentración sérica en el paciente de al menos 0.2 pg/kg.

40. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 7.

41. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc tiene una vida media sérica entre 15 y 30 días.

42. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc se administra al paciente con una frecuencia no mayor de una vez por semana.

43. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, donde la proteína de fusión ActRIIa-Fc se administra al paciente con una frecuencia no mayor de una vez por mes.

44. Un polipéptido que comprende la SEC. ID Nº: 7.

45. Un polipéptido soluble de acuerdo con la reivindicación 44.

46. Un polipéptido que se une a activina de acuerdo con la reivindicación 45.

47. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46 que se une a activina con una KD menor de 1 micromolar.

48. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 47 que se une a activina con una KD menor de 100 nanomolar.

49. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 48 que se une a activina con una KD menor de 10 nanomolar.

50. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 49 que se une a activina con una KD menor de 1 nanomolar.

51. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es al menos 95% puro.

52. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 51 que es al menos 98% puro.

53. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 51 que es acetilado.

54. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es carboxilado.

55. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es glucosilado.

56. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es fosforilado.

57. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que está unido a una porción lipídica.

58. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es acilado.

59. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que comprende polietilenglicol.

60. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que comprende un lípido.

61. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que comprende un fosfato.

62. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que comprende un polisacárido.

63. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que comprende monosacárido.

64. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es PEGilado.

65. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es farnesilado.

66. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que es biotinilado.

67. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 44 que está conjugado a un agente de derivación orgánico.