Animales no humanos cuatro veces transgénicos.

Un ratón transgénico cuyo genoma comprende:

a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteínahumana APP London,

en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a unprimer promotor;

b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, quecomprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unidaoperativamente a un segundo promotor;

c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra elpéptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercerpromotor y;

d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el quedicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuartopromotor.

Animales no humanos cuatro veces transgénicos La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por la pérdida de memoria y deterioro de las funciones cognitivas. La prevalencia de la EA se duplica aproximadamente cada cinco años por encima de los 65 años de edad. En general, aproximadamente entre el 5 y el 10% de los mayores de 65 años se ven afectados. El diagnóstico clínico de la EA sigue siendo el diagnóstico por exclusión. Sólo el examen microscópico post mortem del cerebro ofrece un diagnóstico definitivo basado en la presencia de placas extracelulares de fibrillas que contienen péptidos beta amiloides (A beta) y ovillos intracelulares que contienen proteína tau fosforilada polimerizada. En la mayoría de los casos, la EA aparece tarde en sus síntomas y de forma esporádica. La EA familiar de aparición temprana representa una minoría de los casos, pero ha sido extremadamente importante para la progresión en la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Mutaciones conocidas son la mutación sueca (SFAD) que afecta los codones 670/671 (K670+N y M671+L) y la mutación London que afecta el codón 717 de APP. Todas estas mutaciones afectan al procesamiento proteolítico de APP proporcionando más péptidos amiloidogénicos.

La APP puede ser procesada por al menos tres secretasas: secretasas alfa, beta, y gamma. La beta-secretasa inicia la generación del péptido A-beta mediante la escisión de APP después de la metionina 671 (numeración APP770) que proporciona un fragmento carboxilo terminal de 12 kD retenido en membrana. El fragmento de 12 kD puede a continuación, someterse a una escisión con la secretasa gamma en el dominio de transmembrana hidrófobo para liberar los residuos 40, 42, o 43 del péptido A-beta (Seubert P, Vigo-Pelfrey C, Esch F, Lee M, Dovey H, Davis D, Sinha S, Schlossmacher M, J Whaley, Swindlehurst C. Isolation and quantification of soluble Alzheimer’s betapeptide from biological fluids. Nature. 1992. 359: 325-7) .

Los tratamientos actuales para la EA proporcionan sólo un alivio sintomático modesto. Existe una alta necesidad médica no satisfecha de agentes modificadores de la enfermedad que frenen el curso de la enfermedad y prevengan o retrasen la prevención de la enfermedad en individuos susceptibles. El desarrollo de dichos agentes requiere, entre otros, el progreso en la comprensión de la base molecular de la enfermedad y en el desarrollo de modelos animales.

Un número de líneas transgénicas que sobreexpresan proteínas relacionadas con la EA son conocidos, por ejemplo ratones doble transgénicos que sobreexpresan APP London, y secretasa beta.

La presente invención proporciona un ratón transgénico cuyo genoma incluye a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteína humana APP London, en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un primer promotor;

b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, que comprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un segundo promotor;

c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra el péptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercer promotor y;

d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el que dicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuarto promotor.

El término "patología de enfermedad de Alzheimer (EA) " Se refiere a los cambios patológicos en los pacientes con EA: como por ejemplo la pérdida de densidad sináptica neuronal y el número de sinapsis, disminución de la capacidad cognitiva, y pérdida de memoria. También incluyen placas difusas y neuríticas en el cerebro, que se componen principalmente de péptido beta-amiloide, inclusiones neuronales y / o gliales o depósitos insolubles que se tiñen positivamente con los anticuerpos anti-Abeta.

En particular, la presente invención proporciona un ratón transgénico cuyo genoma comprende a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteína humana APP London, en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un primer promotor;

b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, que comprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un segundo promotor;

c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra el péptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercer promotor y;

d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el que dicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuarto promotor.

APP

APP significa proteína precursora amiloide. Varias formas de cDNA de APP han sido identificadas, codifican entre otras las tres isoformas más abundantes APP695, APP751, y APP770. Estas formas surgen a partir de un único precursor de RNA por corte y empalme alternativo. El gen se extiende por más de 175 kb con 18 exones (Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene. Gene. 1990. 87 (2) :257-63) . APP contiene un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio citoplásmico. A-beta se compone de hasta 28 aminoácidos justo fuera del dominio transmembrana hidrofóbico y hasta 15 residuos de este dominio transmembrana. Así, A-beta es un producto de escisión derivado de APP que se encuentra normalmente en el cerebro y otros tejidos como el corazón, el riñón y el bazo. Sin embargo, los depósitos de A-beta se encuentran generalmente en abundancia sólo en el cerebro. Las formas alternativas de mayor tamaño de APP (APP751, APP770) consisten en APP695 más uno o dos dominios adicionales. APP751 consta de los 695 aminoácidos de APP695 más 56 aminoácidos adicionales en los cuales tiene homología con la familia Kunitz de los inhibidores de las serina proteasas (KPI) (Tanzi RE, McClatchey AI, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL. Protease inhibitors domain encoged by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer’s disease. Nature. 1988. 331:528-30; Weidemann A, Konig G, Burke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K. Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer’s disease A4 amyloid protein. Cell. 1989 Apr 7; 57 (1) :115-26. Kitaguchi N, Takahashi Y, Tokushima Y, Shiojiri S, Ito H. Novel precursor of Alzheimer’s disease amyloid protein shows protease inhibitor y activity. Nature. 1988. Feb 11;331 (6156) :530-2.; Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey AI, Conneally PM, Gusella JF. The genetic defect in familial Alzheimer’s disease is not tightly linked to the amyloid beta-protein gene. Nature. 1987. 329 (6135) :156-7) . APP770 contiene los 751 aminoácidos de la APP751 y un dominio adicional de 19 aminoácidos homólogo para el antígeno de superficie celular de la neurona OX-2 (Weidemann et al 1989. Kitaguchi et al 1988.) . A menos que se indique lo contrario, las posiciones de los aminoácidos referidas en este documento son las posiciones que aparecen en APP770. El número de aminoácidos de las posiciones equivalentes en APP695 y APP751 difieren en algunos casos debido a la ausencia de los dominios OX-2 y KPI. Por convención, las posiciones de aminoácidos de todas las formas de APP están referidas por las posiciones equivalentes en la forma APP770. A menos que se indique lo contrario, esta convención se utiliza en este documento. A menos que se indique lo contrario, todas las formas de APP y fragmentos de APP, incluyen todas las formas de A-beta, referidas en este documento en base a la secuencia de aminoácidos de la APP humana. APP se modifica después de la traducción por la eliminación de la secuencia líder y por la adición de grupos sulfato y de azúcar. El término "APP" incluye también APP mutante, como por ejemplo APP Swedish y APP London.

Una proteína APP humana que comprende una mutación asociada con la enfermedad de Alzheimer (EA) o patología de tipo EA es preferiblemente APPswedish y APPlondon.

El término "APP Swedish" como se usa aquí se refiere a una isoforma de APP como se define anteriormente, que... [Seguir leyendo]

1. Un ratón transgénico cuyo genoma comprende:

a) una primera secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína humana APP Swedish o una proteína humana APP London, en el que dicha primera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un primer promotor;

b) una segunda secuencia de DNA transgénico que codifica una proteína presenilina 2 humana, que comprende una sustitución N141I, en el que dicha segunda secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un segundo promotor;

c) una tercera secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo dirigido contra el péptido amiloide, en el que dicha tercera secuencia de DNA transgénico está unida operativamente a un tercer

promotor y;

d) una cuarta secuencia de DNA transgénico que codifica una cadena pesada de dicho anticuerpo, en el que dicha cuarta secuencia de DNA transgénico está unida operativamente al tercer promotor o a un cuarto promotor.

2. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tercera y cuarta secuencia de DNA transgénico codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo Mab11 anti-Abeta.

3. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el primer y segundo promotor son 25 promotores neuronales.

4. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el primer y segundo promotor son promotores específicos de cerebro.

5. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tercer y/o cuarto promotor es un promotor del gen MHC de clase I.

6. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tercer y/o cuarto promotor está combinado con un potenciador de IgH.

7. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ratón es homozigoto para al menos una de las secuencias de DNA transgénico.

8. La utilización de ratones cuatro veces transgénicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como 40 modelo de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

9. La utilización de ratones cuatro veces transgénicos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como modelo de prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9