Análogo sintético de scFv de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 6313/G2 (anti-receptor de tipo 1 de la angiotensina ll).

Una molécula de unión específica que se une específicamente a un péptido que tiene la secuencia deaminoácidos de EDGIKRIQDD procedente del receptor de tipo 1 de la angiotensina II y que no reduce la presiónarterial en reposo y que comprende un polipéptido que tiene un dominio VL de inmunoglobulina ligado a un dominioVH de inmunoglobulina en donde el dominio VL comprende las regiones determinantes de la complementariedad(CDR) VLCDR1,

VLCDR2 y VLCDR3, y en donde el dominio VH comprende las regiones determinantes decomplementariedad (CDR) VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, teniendo cada una una de las siguientes secuencias deaminoácidos respectivas, en donde

VHCDR1 es GYSFTGYNMN o GYSFTGYNMS

VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3 es EVDY

VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2 es LVSNLES o LVSDLED

VLCDR3 es QHIRELTRSEG

o CDR con una secuencia de aminoácidos con al menos 85% de identidad con estas.

Análogo sintético de scFv de las regiones variables del anticuerpo monoclonal 6313/G2 (anti-receptor de tipo 1 de la angiotensina II)

La presente invención se refiere a un análogo sintético de scFv (R6313/G2) de los dominios variables del anticuerpo monoclonal 6313/G2 anti-receptor de tipo 1 de la angiotensina II.

La angiotensina II desempeña un papel central en la homeostasis de electrolitos en mamíferos y en el control de la presión arterial (Peach Physiol. Rev 57 313-370 (1977) ; Vinson et al. "The Adrenal Cortex", Prentice Hall, Englefield Heights (1992) ) . Se han reconocido dos tipos principales de receptores de la angiotensina II, los tipos designados 1 y 2 (AT1 y AT2) , pero la mayoría de las acciones conocidas en detalle de la angiotensina II tienen lugar a través del subtipo AT1 (Herblin et al. Am. J. Hypertens. 4 299S-302S (1991) ; Ouali et al. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 43 271280 (1992) ) .

Un anticuerpo monoclonal 6313/G2 para el subtipo de receptor AT1 (Barker et al. J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993) ) se ha utilizado para estudiar la distribución del receptor (Vinson et al. Mol. Med. Today 1 35-38 (1995) ) . Se ha sugerido que el anticuerpo monoclonal se podría utilizar como agente terapéutico para el control vasoconstrictor, por ejemplo, en el tratamiento de la hipertensión o de otra contracción de células del músculo liso (por ejemplo, uterino) .

El anticuerpo se ha utilizado como un agente específico para tomografía en diversos tejidos, por ejemplo, el cáncer de laringe (Marsigliante et al. Cancer Letters 110 19-27 (1996) ) , riñón (Harrison-Bernard et al. Am. J. Physiol. 42 F170-F177 (1997) ; Cheng et al. Am. J. Physiol. 43 F10-F17 (1998) ) y cerebro (Yang et al. J. Neuroscience 17 16601669 (1997) ) . Se ha observado que el anticuerpo bloquea la internalización del receptor AT1, inducida con angiotensina II y la activación de PKC, pero en cambio favorece la respuesta del calcio (Kapas et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 204 1292-1298 (1994) ; Vinson et al. J. Endocrinol. 141 R5-R9 (1994) ) . Se ha descrito la presencia de receptores AT1 y AT2 en los tumores de mama, con una producción local de angiotensina (Inwang et al. Brit. J. Cancer 75 1279-1283 (1997) ; Tahmasebi et al. Eur. J. Cancer 34 1777-1782 (1998) ) .

El anticuerpo monoclonal 6313/G2 es secretado por una línea de células de hibridoma, depositada el 22 de julio de 1993 en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) , Porton Down, Reino Unido, bajo el Tratado de Budapest, y designada por el número de entrada 93072117. El depósito fue hecho por el Dr. Gavin P Vinson y el Dr. Stewart Barker, Departamento de Bioquímica, Queen Mar y & Westfield College, Mile End Road, Londres El 4NS. El depositante ha autorizado al solicitante para hacer referencia al material depositado en la solicitud de patente y ha dado su consentimiento sin reservas e irrevocable para que el material depositado esté a disposición del público, de conformidad con la Regla 28 (1) (d) del Convenio sobre la Patente Europea.

La línea celular de hibridoma produce un anticuerpo que se une específicamente a los residuos aminoacídicos 8 a 17 del receptor AT1 del músculo liso vascular de rata, secuencia que también se encuentra en el receptor AT1 de las células humanas y bovinas. La secuencia del epítopo es la siguiente:

EDGIKRIQDD.

O, de forma alternativa, expresada como,

NH2-Glu-Asp-Gly-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Asp-Asp-COOH

Se han preparado anticuerpos monoclonales para la secuencia peptídica que comprende la secuencia N-terminal del receptor de tipo 1 de la angiotensina II (Barker et al. Journal of Molecular Endocrinology 11 241-245 (1993) ; documento WO 95/09186) . Se ha descrito que tales anticuerpos monoclonales tienen usos terapéuticos adicionales en ciertas afecciones médicas en las que dichos usos no se habían sugerido ni mostrado anteriormente (documento WO2004/018519) . Estos efectos terapéuticos se observan en la capacidad de los anticuerpos monoclonales para bloquear las acciones perjudiciales de la angiotensina II en las afecciones médicas en cuestión, sin menoscabo de las acciones beneficiosas de la molécula.

Se ha descubierto ahora que análogos sintéticos de scFv de anticuerpos monoclonales específicos del receptor AT1 poseen propiedades ventajosas e inesperadas que contribuyen al uso de tales análogos en la terapia o en el tratamiento de enfermedades. Los inventores han producido tanto análogos de scFv de múrido como variantes humanizadas de los análogos de scFv de múrido.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de unión específica que se une específicamente a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de EDGIKRIQDD procedente del receptor de tipo 1 de la angiotensina II y que no reduce la presión arterial en reposo y que comprende un polipéptido que tiene un dominio VL de inmunoglobulina ligado a un dominio VH de inmunoglobulina, en donde el dominio VL comprende las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR, del inglés, “Complementarity Determining Regions”) VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, y en donde el dominio VH comprende las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, teniendo cada una una de las siguientes secuencias de aminoácidos respectivas, en donde VHCDR1 es GYSFTGYNMN o GYSFTGYNMS VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG VHCDR3 es EVDY

VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH VLCDR2 es LVSNLES o LVSDLED VLCDR3 es QHIRELTRSEG

o CDR con una secuencia de aminoácidos con al menos 85% de identidad con estas.

En una realización de la invención, las CDR de la molécula de unión específica tienen las siguientes secuencias de aminoácidos VHCDR1 es GYSFTGYNMN o GYSFTGYNMS VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG VHCDR3 es EVDY VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH VLCDR2 es LVSNLES o LVSDLED VLCDR3 es QHIRELTRSEG.

Las CDR se designan de acuerdo con una combinación de la definición de secuencia conservada (Kabat et al. en "Sequences of Proteins of Immunological Interest ", Nat’l. Inst. Health, Bethesda, MD (1987) ) , y la definición estructural (Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196:901-17 (1987) ) . Estas definiciones también fueron descritas posteriormente en Carter et al., Proc Nat’l Acad Sci USA. 89:4285-9 (1992) .

Empleando los códigos de tres letras y de una letra, los aminoácidos también se pueden designar del modo siguiente: glicina (G o Gly) , alanina (A o Ala) , valina (V o Val) , leucina (L o Leu) , isoleucina (I o Ile) , prolina (P o Pro) , fenilalanina (F o Phe) , tirosina (Y o Tyr) , triptófano (W o Trp) , lisina (K o Lys) , arginina (R o Arg) , histidina (H o His) , ácido aspártico (D o Asp) , ácido glutámico (E o Glu) , asparagina (N o Asn) , glutamina (Q o Gln) , cisteína (C o Cys) , metionina (M o Met) , serina (S o Ser) y treonina (T o Thr) . Cuando un residuo puede ser ácido aspártico o asparagina, se pueden utilizar los símbolos Asx o B. Cuando un residuo puede ser ácido glutámico o glutamina, se pueden utilizar los símbolos Glx o Z. Las referencias a ácido aspártico incluyen aspartato, y a ácido glutámico incluyen glutamato, a menos que el contexto indique lo contrario.

La presente invención también se extiende a variantes de las secuencias peptídicas mencionadas anteriormente. Un ejemplo de una variante de la presente invención es una proteína de fusión que comprende un péptido tal y como se ha definido anteriormente, además de la sustitución de uno o varios aminoácidos por uno o varios aminoácidos distintos. El experto en la técnica es consciente de que diversos aminoácidos tienen propiedades similares. Uno o varios de tales aminoácidos de una sustancia se pueden sustituir frecuentemente por uno o varios aminoácidos distintos, sin perder una actividad deseada de esa sustancia.

Así, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina se pueden sustituir frecuentemente entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas) . Entre estas posibles sustituciones, se prefiere que la glicina y la alanina se empleen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que valina, leucina e isoleucina se empleen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales alifáticas más largas que son hidrófobas) . Otros aminoácidos que se pueden sustituir frecuentemente entre sí incluyen: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas) ; lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas) ; aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas) ; asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de tipo amida) ; y cisteína y metionina (aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de unión específica que se une específicamente a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de EDGIKRIQDD procedente del receptor de tipo 1 de la angiotensina II y que no reduce la presión arterial en reposo y que comprende un polipéptido que tiene un dominio VL de inmunoglobulina ligado a un dominio VH de inmunoglobulina en donde el dominio VL comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, y en donde el dominio VH comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, teniendo cada una una de las siguientes secuencias de aminoácidos respectivas, en donde VHCDR1 es GYSFTGYNMN o GYSFTGYNMS VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG VHCDR3 es EVDY VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH VLCDR2 es LVSNLES o LVSDLED VLCDR3 es QHIRELTRSEG

o CDR con una secuencia de aminoácidos con al menos 85% de identidad con estas.

2. Una molécula de unión específica según la reivindicación 1, en donde las CDR tienen las siguientes secuencias de aminoácidos

VHCDR1 es GYSFTGYNMN VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG VHCDR3 es EVDY VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH VLCDR2 es LVSNLES VLCDR3 es QHIRELTRSEG

o VHCDR1 es GYSFTGYNMS VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG VHCDR3 es EVDY VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH VLCDR2 es LVSNLES VLCDR3 es QHIRELTRSEG

o VHCDR1 es GYSFTGYNM VHCDR2 es NIDPYYGGTTYNQKFKG VHCDR3 es EVDY VLCDR1 es RASKSVSTSGYSYMH VLCDR2 es LVSDLED VLCDR3 es QHIRELTRSEG.

3. Una molécula de unión específica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal y como se muestra en la Figura 14.

4. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en medicina.

6. Una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento del cáncer.

7. El uso de una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento del cáncer.

8. Un preparado combinado de una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y angiotensina II para la administración separada, simultánea o sucesiva para el tratamiento del cáncer en un sujeto.

9. Una composición que comprende una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y angiotensina II.

10. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y angiotensina II