Análisis miniaturizado de alto rendimiento de ácidos nucleicos.

Un método que comprende los pasos de

a) proporcionar una pluralidad de cuentas,

caracterizado porque cada cuenta comprende un par de cebadoresde amplificación específicos de secuencia, caracterizado además porque uno de dichos cebadores se unen a lacuenta mediante un enlazante fotoescindible,

b) capturar las moléculas de ácidos nucleicos de interés de una muestra,

c) aislar los clones de dicha pluralidad de cuentas,

d) inducir la fotoescisión de dicho primer cebador, mientras que el segundo cebador permanece unido de formacovalente,

e) amplificar de forma clonal dichos ácidos nucleicos creando así múltiples productos de amplificación,

f) analizar dichos productos de amplificación.

Análisis miniaturizado de alto rendimiento de ácidos nucleicos Esta invención está relacionada con el área de análisis de ácidos nucleicos y en particular la detección miniaturizada y altamente paralela de secuencias de ácidos nucleicos, y el análisis de diferencias en las secuencias de ácidos nucleicos.

La invención se basa en la idea de proporcionar un soporte sólido al que se unen los cebadores específicos de secuencia, siendo uno de ellos escindible y el otro no escindible, para poder analizar secuencias específicas o detectar la presencia de un SNP, una mutación o cualquier especie particular de DNA o RNA de interés.

Antecedentes de la materia Recientemente, se describió un sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado basado en la secuenciación de pirofosfato que permite la secuenciación de un genoma bacteriano esencialmente en no más de una semana (WO 04/70007, WO 05/03375, Margulies, M., et al., Nature 437 (2005) 376-80) . A partir de un DNA genómico fragmentado, se unen fragmentos de una sola molécula a cuentas que se capturan en una emulsión de mezcla de reacción de PCR en aceite. Entonces, la amplificación resulta en una biblioteca de DNA amplificado de forma clónica en el que cada cuenta es portadora de varias copias del mismo fragmento.

Tras romper la emulsión y desnaturalizar los productos de PCR en cadenas sencillas, las cuentas se depositaron en múltiples pocillos de una placa picotitulada de fibra óptica de forma que un pocillo contenga no más de una única cuenta. A continuación, en una secuenciación por reacción de síntesis, se realiza una reacción de extensión de los cebadores, en la que se proporcionan los 4 nucleósidos trifosfato diferentes A, G, C, y T o sus respectivos análogos en una serie repetitiva de eventos y la secuencia de la cadena naciente se infiere a partir de los productos químicos derivados a partir de la reacción de extensión catalizada por la polimerasa de DNA. En particular, la secuenciación mediante una reacción de síntesis es una reacción de secuenciación de pirofosfato, que se caracteriza por que la generación of pirofosfato se detecta como sigue:

PPi + adenosina 5’ fosfosulfato (APS) - ATP, catalizado en presencia de apirasa ATP + luciferina - luz + oxiluciferina, catalizada en presencia de luciferasa. Detección de la luminiscencia de la oxiluciferina

Con el sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado descrito en la WO 04/70007 y la WO 05/03375, pueden realizarse más de 1.000.000 de reacciones de secuenciación de pirofosfato de forma simultánea. La generación de pirofosfato inicia una cascada de reacción luminiscente y la luz se detecta finalmente con una cámara CCD.

Con respecto a esta tecnología, la WO 04/69849 describe un método para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo, cada secuencia de una biblioteca de DNA, transcriptoma o genoma) de una forma rápida y económica en un único tubo de reacción. Más concretamente, la WO 04/69849 describe una amplificación clónica simultanea (por ejemplo, mediante PCR) de una pluralidad de muestras (tantas como varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. En este contexto, la WO 04/69849 proporciona un método para encapsular una pluralidad de muestras de DNA individualmente en una microcápsula de una emulsión (es decir un microreactor) , realizando la amplificación de la pluralidad de muestras encapsuladas de ácidos nucleicos de forma simultánea, y liberando dicha pluralidad de cadenas de DNA amplificadas de las microcápsulas para subsiguientes reacciones. Por ejemplo, copias únicas de las especies molde de ácido nucleico se hibridan en las cuentas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos químicos que se unen a los moldes de ácidos nucleicos. Las cuentas se suspenden en una solución de amplificación completa y se emulsionan para producir microreactores (normalmente 100 a 200 micras de diámetro) . Tras esto, la amplificación (por ejemplo, PCR) se utiliza para incrementar de forma clonal el número de copias de las especies de molde inicial en los microreactores, y estas copies se unen a las cuentas de captura en los microreactores. Alternativamente, las cuentas de captura se añaden a una mezcla de reacción de amplificación que comprende moldes de ácidos nucleicos y esta mezcla se emulsiona para producir microreactores. La amplificación (por ejemplo, PCR) se utiliza para incrementar de forma clonal el número de copias de las especies de molde inicial en los microreactores, y estas copies se unen a las cuentas de captura en los microreactores. Así, los microreactores de acuerdo con la WO 05/03375 permiten la amplificación clonal simultanea y discreta de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o reactivos, o dominación de un molde particular o grupo de moldes (por ejemplo, sesgo de PCR) .

Sin embargo, de acuerdo con la WO 05/03375 es necesario realizar un paso de ligación del adaptador, en el que una pluralidad de diferentes moléculas de ácidos nucleicos se marca con una secuencia adaptadora que a continuación puede unirse a una cuenta con una secuencia adaptadora complementaria unida covalentemente.

Otra técnica de análisis de DNA importante es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) analítica. La cuantificación de la PCR, sin embargo, hasta la fecha se basa en formas de medida análogas. En algunos casos, sin

embargo, un pricipio de cuantificación digital sería muy deseable, por ejemplo en áreas como:

- detección del cáncer: cuantificación de alelos mutantes en un fondo en exceso de tipo salvaje

- detección de desequilibrio alélico

- expresión génica de transcritos raros y/o alelos mutantes en transcritos

- detección viral y cuantificación

Así, la disponibilidad de de un contador digital de DNA/ cDNA/ mRNA aborda una necesidad no cubierta en la medicina molecular, muy relevante por ejemplo para el diagnóstico del cáncer, células tumorales circulantes, células embrionarias prenatales, en los que un evento específico se debe detectar de entre un elevado ruido de fondo.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método mejorado y reactivos mejorados para el análisis simultáneo de múltiples moléculas de ácido nucleico.

En un aspecto particular, es objeto de la presente invención proporcionar un soporte sólido o una pluralidad de soportes sólidos que puedan utilizarse para mejorar el flujo de trabajo de la secuenciación descrito anteriormente o permitir el contaje digital de la PCR.

Varios soportes sólidos que comprenden ácidos nucleicos inmovilizados, como las cuentas que comprenden oligonucleótidos inmovilizados, son bien conocidos en la materia. El diseño exacto y la configuración de estas cuentas depende de la aplicación para la que se utilicen: Steinberg-Tatman, G., et al. (Bioconjugate Chemistr y 17 (2006) 841-848) describe un método para la síntesis de cuentas con dos oligonucleótidos diferentes unidos a la superficie a través de un enlazante no escindible. Se utiliza un oligonucleótido como sonda de captura específico de secuencia y otro como secuencia decodificante.

Se han descrito realizaciones y aplicaciones específicas, por ejemplo, en las patentes WO 98/20019, WO 2008/061193, WO 2007/136736, y US 2007/087362.

La US 5.639.603 describe las cuentas con una o más colas decodificantes de oligonucleótidos inmovilizadas.

Xu, Xiaoyang; Rosi, Nathaniel, L.; Wang, Yuhuang; Huo, Fengwei; Mirkin, Chad A. Journal of the American Chemical Society 128 (29) (2006) 9286-9287 describe partículas de oro con dos oligonucleótidos diferentes unidos a la superficie para conseguir nanoestructuras multipartículas ordenadas.

Las patentes WO 2001/062982 y US 5.641.658 describen una PCR sobre superficies de cuentas con dos cebadores inmovilizados. El método de PCR se denomina amplificación puente.

La WO 2001/012862 describe un método para generar una serie de oligonucleótidos mediante la escisión de diferentes oligonucleótidos que están unidos a un sustrato a través de un enlazante escindible diferente.

La WO 2007/111937 describe un chip de pares de cebadores, en el que al menos un cebador está unido a través de un enlace escindible, para el enriquecimiento de DNA genómico utilizado en secuenciación.

La KR 2007044677 describe cuentas con un primer y un segundo cebador de PCR inmovilizado para su utilización en una PCR en emulsión. La liberación de los cebadores se consigue modificando el valor del pH. Sin embargo, modificar el valor de pH tiene la desventaja de que puede producir potenciales reacciones colaterales no deseadas y además... [Seguir leyendo]

1. Un método que comprende los pasos de

a) proporcionar una pluralidad de cuentas, caracterizado porque cada cuenta comprende un par de cebadores de amplificación específicos de secuencia, caracterizado además porque uno de dichos cebadores se unen a la cuenta mediante un enlazante fotoescindible, b) capturar las moléculas de ácidos nucleicos de interés de una muestra, c) aislar los clones de dicha pluralidad de cuentas, d) inducir la fotoescisión de dicho primer cebador, mientras que el segundo cebador permanece unido de forma covalente, e) amplificar de forma clonal dichos ácidos nucleicos creando así múltiples productos de amplificación, f) analizar dichos productos de amplificación.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paso c) comprende la generación de una emulsión en la que cada cuenta se encapsula en una micela simple.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el paso f) comprende la distribución de dicha pluralidad de cuentas en las cavidades de una placa micro o picotitulada y detector dichos productos de amplificación.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el paso f) comprende además una reacción de secuenciación de dichos productos de amplificación.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha reacción de secuenciación es secuenciación mediante reacción de síntesis.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que se monitoriza la generación de dichos productos de amplificación.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dichos productos de amplificación se detectan mediante una entidad fluorescente de unión específica al DNA de doble cadena o una sonda de hibridación específica de secuencia.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dichos productos de amplificación se analizan mediante un gradiente térmico.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paso c) comprende la distribución de dicha pluralidad de cuentas en las cavidades de una placa micro o picotitulada.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los pasos e) y f) se realizan de forma simultanea mediante PCR de tiempo real.

11. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 10, en el que dicho al menos un cebador que está unido a la cuenta mediante un enlazante escindible es portador de un marcaje detectable.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho marcaje detectable se selecciona de un grupo que consiste de marcaje de masa, marcaje de color, marcaje e-tag y un hapteno que es detectable mediante un anticuerpo.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, que se caracteriza en que dicho marcaje detectable es un marcaje fluorescente que está preferiblemente atenuado mientras dicho cebador marcado no haya sido elongado.

14. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13 que se caracteriza en que cada miembro de la pluralidad de cebadores que se unen a la cuenta mediante un enlazante escindible es portador de un marcaje detectable diferente.

15. El uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 5 para el análisis mutacional cuantitativo.

16. El uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 5 para monitorizar la expresión génica.

17. El uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 11 para el análisis mutacional cuantitativo mediante la realización de amplificación específica de alelo.

18. El uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 11 para monitorizar la expresión génica.

19. El uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 11 para la cuantificación relativa o absoluta de ácidos nucleicos.

20. El uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 17 a 19, que se caracteriza en que cada miembro de la pluralidad de cebadores que se unen a la cuenta mediante un enlazante escindible es portador de un marcaje detectable diferente.