Análisis de ácido nucleico metilado.

Un procedimiento para enriquecer fragmentos de ácido nucleico metilados en una muestra de fragmentos de ácidonucleico,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra de fragmentos de ácido nucleico con un anticuerpo específico para un nucleósido metilado en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo al nucleósido metilado;

(b) seleccionar los fragmentos de ácido nucleico unidos al anticuerpo específico para un nucleósido metilado.caracterizado porque:

antes de la etapa (a): las cadenas de los fragmentos de ácido nucleico de doble cadena en la muestra sonseparadas.

Análisis de ácido nucleico metilado

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a procedimientos y materiales para uso en el enriquecimiento y análisis de ADN metilado y en la identificación de sitios metilados aberrantemente en una enfermedad.

Técnica antecedente Se han encontrado bases nucleótidas metiladas tanto en procariotas como en eucariotas (Achwal et al., 1983) . Las encontradas en eucariotas incluyen 5-metilcitosina, 6-metiladenina y 7-metilguanina en el ADN (Achwal et al, 1983) y 5metilcitosina (Hernandez-Blazquez et al, 2000) y 7-metilguanosina (Tebib et al, . 1997) en el ARN. La metilación de reversible de las citosinas, normalmente en dinucleótidos CpG, es una modificación común del ADN en eucariotas superiores, incluyendo plantas y animales.

La metilación del ADN puede conducir a una represión transcripcional y, de esta manera, está implicada en la regulación génica y la impronta genética de mamíferos, tales como aquellos para el factor de crecimiento de insulina y de su receptor, y el gen Xist. La metilación del ADN es un regulador epigenético, ya que la modificación no cambia la secuencia del ADN, pero se hereda a través de la división celular. Una metilación aberrante del ADN puede causar una enfermedad. En particular, una metilación aberrante del ADN puede resultar en una mayor expresión de proto-oncogenes o una disminución de la expresión de genes supresores de tumores. De esta manera, una regulación deficiente de la metilación del ADN es una característica fenotípica de muchos cánceres humanos (Jones y Baylin, 2002) . La imagen resultante es la de una reducción global de la cantidad de citosina metilada con una hipermetilación coincidente de un subconjunto de promotores, que en algunos casos está ligada a genes supresores de tumores inactivos. Sin embargo, la ubicación genómica de esta hipometilación es desconocida, así como la frecuencia y la especificidad de la metilación aberrante de un promotor.

Dada la importancia de la metilación del ADN para la función celular normal y anormal y su potencial como objetivo de fármacos y como una herramienta de diagnóstico en oncología, los enfoques técnicos para identificar la metilación del ADN son altamente deseables (Fazzari y Greally, 2004) . El uso de anticuerpos específicos para los ácidos nucleicos metilados se menciona en los documentos WO 02/00842, WO 02/101353 y WO 2004/065625.

Frecuentemente, los protocolos actuales disponibles para detectar el ADN metilado requieren el uso de endonucleasas de restricción sensibles a modificación (MSRE) o modificación diferencial de bases que usan productos químicos, por ejemplo, bisulfito, hidrazina o permanganato (Rein et al., 1998) seguido de un análisis de secuencia de ADN. Aunque los procedimientos de modificación diferencial de bases pueden asignar una base metilada a una posición de nucleótido precisa en un tramo de ADN, estos procedimientos son demasiado laboriosos para ser aplicados a un análisis a gran escala (genoma completo) . El uso de enzimas de restricción sensibles a metilación puede ser usado para un análisis de genoma completo pero el número de sitios que pueden ser examinados está limitado por el número de sitios de restricción apropiados en el ácido nucleico. Esto significa que dichos procedimientos no pueden asignar la ubicación de una base modificada en un cromosoma, de manera tan precisa. Además, los procedimientos de detección, químicos y enzimáticos, actuales sólo pueden realizarse con un ADN de calidad relativamente alta.

De esta manera, puede verse que los procedimientos novedosos para el enriquecimiento o la detección de ácido nucleico metilado, así como la identificación del ADN metilado aberrantemente en una enfermedad, proporcionarían una contribución a la técnica.

Divulgación de la invención Los presentes inventores han demostrado que pueden usarse anticuerpos específicos para nucleósidos metilados en procedimientos para el enriquecimiento y la identificación, de manera eficiente, de ácidos nucleicos metilados específicos en muestras de fragmentos de ácido nucleico. Usando este nuevo enfoque, los presentes inventores han observado un enriquecimiento de las secuencias metiladas superior en hasta 120 veces en relación a un control no metilado, según se detecta mediante una PCR en tiempo real. Los procedimientos son independientes de la secuencia de los fragmentos de ácido nucleico, no requieren una alta calidad de ácido nucleico, y son fácilmente susceptibles a análisis genómicos a gran escala, por ejemplo, cuando se combinan con los procedimientos convencionales de detección de secuencia de ADN. Además de permitir la determinación de qué secuencias en una muestra están metiladas, los presentes inventores han demostrado también que el enriquecimiento mediante procedimientos de la invención, basados en inmunoprecipitación, es dependiente de la dosis y, de esta manera, puede ser usado para cuantificar el grado de metilación de una secuencia.

Los anticuerpos específicos para bases modificadas han sido usados anteriormente para la detección de la cantidad global y la ubicación general de las bases modificadas. Por ejemplo, se ha demostrado que los anticuerpos específicos para 5-metilcitidina (M5C) reaccionan con M5C en ADN de mamífero unido a un papel de nitrocelulosa (Achwal et al, 1983; Achwal & Chandra, 1982) . También se ha usado inmunofluorescencia para determinar las regiones cromosómicas con una alta frecuencia de M5C (Barbin et al., 1994) . El anticuerpo monoclonal de ratón contra 5-metilcitidina se ha usado también anteriormente para detectar alteraciones en la excreción urinaria de nucleósidos en pacientes con cáncer (Tebib et al., 1997) y para visualizar la distribución de secuencias metiladas a lo largo de los cromosomas de mamíferos en células normales y malignas (Hernández-Blazquez et al, 2000; Mayer et al, 2000) . Sin embargo, dichos anticuerpos no han sido previamente divulgados o sugeridos para el enriquecimiento de ácidos nucleicos metilados en muestras de ácido nucleico.

De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para enriquecer fragmentos metilados de ácido nucleico en una muestra de fragmentos de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra de fragmentos de ácido nucleico con un anticuerpo específico para un nucleósido metilado bajo condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo al nucleósido metilado;

(b) seleccionar los fragmentos de ácido nucleico unidos al anticuerpo.

Antes de seleccionar los fragmentos de ácido nucleico unidos al anticuerpo específico para un nucleósido metilado, los fragmentos metilados y no metilados pueden ser separados en base a la unión de los fragmentos metilados al anticuerpo.

La presente invención puede comprender además una etapa de separación de las cadenas de cualquier fragmento de ácido nucleico, de doble cadena, en la muestra para formar una muestra de fragmentos de ácido nucleico de cadena simple, antes de poner en contacto la muestra de fragmentos de ácido nucleico de cadena simple con un anticuerpo específico para un nucleósido metilado.

En realizaciones preferentes, la invención proporciona un procedimiento para caracterizar o identificar los fragmentos de ácido nucleico metilados a partir de una muestra de fragmentos de ácido nucleico, en el que el procedimiento incluye además la etapa de:

(c) caracterizar uno o más de los fragmentos de ácidos nucleicos metilados.

Por "enriquecimiento" se entiende un aumento en la proporción de una categoría particular de fragmento de ácido nucleico en o a partir de una muestra de fragmentos de ácido nucleico. Preferentemente, el enriquecimiento es de al menos 5, 10, 20, 30, 50 ó 100 veces.

En otro aspecto, la invención proporciona la distribución de la metilación del ADN en una enfermedad y, por lo tanto, está dirigida a una intervención terapéutica, así como a diagnósticos, pronósticos y a marcadores indirectos útiles en la lucha contra el cáncer y otras enfermedades.

Ahora, se describirán algunas realizaciones preferentes.

Naturaleza del ácido nucleico Aunque el procedimiento descrito anteriormente puede ser aplicado a una muestra de cualquier tipo de ácido nucleico, preferentemente, el ácido nucleico es ADN.

Los ejemplos de nucleósidos metilados incluyen citidina metilada (por ejemplo, 5-metil citidina) , adenosina metilada (por ejemplo, 6-metil adenosina) y guanosina metilada (7-metil guanosina) . En una realización preferente, el nucleósido metilado es metil citidina. De manera más particularmente preferente, el nucleósido metilado es 5-metil... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para enriquecer fragmentos de ácido nucleico metilados en una muestra de fragmentos de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra de fragmentos de ácido nucleico con un anticuerpo específico para un nucleósido metilado en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo al nucleósido metilado;

(b) seleccionar los fragmentos de ácido nucleico unidos al anticuerpo específico para un nucleósido metilado.

caracterizado porque:

antes de la etapa (a) : las cadenas de los fragmentos de ácido nucleico de doble cadena en la muestra son separadas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa adicional de (c) caracterizar uno o más de los fragmentos de ácidos nucleicos metilados.

3. El uso del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la detección de alelos metilados de manera diferente en una muestra de fragmentos de ácido nucleico.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proporción de fragmentos de ácidos nucleicos metilados en, o recogidos de, la muestra de fragmentos de ácido nucleico es aumentada al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces o al menos a 100 veces entre las etapas (a) y (b) .

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los fragmentos de ácido nucleico son fragmentos de ADN.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nucleósido metilado es metilcitidina.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nucleósido metilado es 5metilcitidina.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la selección de los fragmentos de ácido nucleico unidos al anticuerpo se realiza fijando o uniendo los anticuerpos a un sustrato sólido y separando este sustrato sólido de la fase líquida de la muestra.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el sustrato sólido se une específicamente al anticuerpo específico para un nucleósido metilado.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el sustrato sólido comprende un segundo anticuerpo específico para el anticuerpo específico para un nucleósido metilado.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el sustrato sólido está en forma de perlas.

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el sustrato sólido es magnético.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además separar los fragmentos de ácidos nucleicos metilados del anticuerpo específico para el nucleósido metilado.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la separación de los fragmentos de ácidos nucleicos metilados del anticuerpo específico para el nucleósido metilado comprende la incubación de los fragmentos de ácidos nucleicos unidos al anticuerpo con una proteinasa.

15. Procedimiento de caracterización del estado de metilación de una muestra de ADN genómico, que comprende:

(i) fragmentar la muestra de ADN genómico para proporcionar una muestra de fragmentos de ácido nucleico, y

(ii) llevar a cabo el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14 sobre la muestra de fragmentos de ácidos nucleicos obtenidos en (i) .

16. Procedimiento para comparar el estado de metilación de al menos dos muestras de fragmentos de ácido nucleico, que comprende:

(i) llevar a cabo el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14 sobre cada muestra de 14

fragmentos de ácido nucleico, y

(ii) comparar los resultados obtenidos en (i) de una muestra de ácido nucleico con los de al menos otra muestra de ácido nucleico.

17. Procedimiento de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad asociada con la metilación de un fragmento de ácido 5 nucleico específico en un individuo, que comprende:

(i) llevar a cabo el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14 sobre una muestra de fragmentos de ácido nucleico del individuo,

(ii) correlacionar el resultado obtenido en (i) con el estado de la enfermedad del individuo.

18. Procedimiento para la detección de cambios en la metilación de ácido nucleico en un paciente, con el tiempo, que 10 comprende:

(i) tomar una muestra de tejido obtenida del paciente en un punto temporal,

(ii) repetir la etapa (i) al menos para un punto temporal adicional;

(iii ) extraer el ácido nucleico de cada muestra de tejido para proporcionar una muestra de ácido nucleico para cada punto temporal, y

(iv) llevar a cabo el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14 sobre cada muestra de ácido nucleico para cada punto temporal, para caracterizar si la secuencia de ácido nucleico está metilada, y/o en qué grado.

19. Procedimiento para correlacionar los cambios en la metilación de ácido nucleico con los síntomas clínicos de una enfermedad, que comprende las etapas según la reivindicación 18, que comprende además:

(a) registrar los síntomas clínicos de una enfermedad, observados en el paciente en cada punto temporal, y

(b) comparar los síntomas clínicos registrados en cada punto temporal con los resultados obtenidos en la etapa (iv) .

20. Procedimiento según la reivindicación 18 o la reivindicación 19, que comprende además el almacenamiento de cada muestra de tejido y llevar a cabo la etapa (ii) para una pluralidad de muestras al mismo tiempo.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la enfermedad es cáncer. 25