alfa-Galactosidasa de Bifidobacterium bifidum y su uso.

Una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia aminoacídica como se da en SEQ. ID.NO: 2.

alfa-Galactosidasa de Bifidobacterium bifidum y su uso La presente invención se refiere a una α-galactosidasa novedosa con actividad transgalactosilante capaz de convertir melibiosa en disacáridos de α-galactobiosa. En particular, se refiere a una α-galactosidasa aislada de una cepa descubierta recientemente de Bifidobacterium bifidum.

La invención se refiere en particular a secuencias de ADN que codifican la enzima α-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por dicha secuencia de ADN y a una célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN

o que contiene un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención se refiere también al uso de la enzima codificada por la secuencia de ADN, o al hospedador celular que contiene la secuencia de ADN o vector recombinante, para producir α-galactobiosa.

Las bifidobacterias colonizan de forma natural el tracto intestinal inferior, un entorno que es pobre en monosacáridos y disacáridos, puesto que dichos azúcares se consumen preferentemente por el hospedador y los microbios presentes en el tracto intestinal superior. Para sobrevivir en el tracto intestinal inferior, las bifidobacterias producen diversas clases de exoglucosidasas y endoglucosidasas en formas unida a superficie y/o extracelular mediante las que pueden utilizar diversos carbohidratos.

Además de la actividad hidrolasa, algunas enzimas de bifidobacterias muestran actividad transferasa. Esta actividad de transglucosilación de glucosidasas se usa extensamente para la síntesis enzimática de diversos oligosacáridos que han probado actuar como factores promotores del crecimiento de bifidobacterias.

Es conocido que miembros de bifidobacterias producen enzimas β-galactosidasas que están implicadas en el metabolismo bacteriano de la lactosa. Moller, P.L. et al en Appl & Environ. Microbial., (2001) , 62, (5) , 22762283 describen el aislamiento y caracterización de tres genes de β-galactosidasa de una cepa de Bifidobacterium bifidum. Encontraron que las tres β-galactosidasas eran capaces de catalizar la formación de galactooligosacáridos β-ligados mediante transgalactosilación.

Es conocido que algunas especies de bifidobacterias, pero no B. bifidum, producen α-galactosidasas así como βgalactosidasas. Las α-galactosidasas pertenecen al grupo de las glucosilo hidrolasas y pueden clasificarse en dos grupos basándose en su especificidad de sustrato, concretamente, un grupo es específico de sacáridos pequeños tales como p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido, melibiosa y rafinosa, y el otro grupo puede liberar galactosa de galactomananos tales como goma guar, además de sustratos pequeños.

"Secuencia aminoacídica de ORF de Bifidobacteria longum NCC2705 de SEQ ID No. 919" de la base de datos Geneseq [Online] de 19 de noviembre de 2002, XP002431983, recuperada del nº de acceso a EBI GSP: ABP66175, nº de acceso a la base de datos ABP 66175, da a conocer una secuencia aminoacídica de B. longum.

"Alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22) " de la base de datos UniProt [Online] de 1 de noviembre de 1999, XP002431984 recuperada del nº de acceso a EBI UNIPROT: Q9XCX2, nº de acceso a la base de datos Q9XCX2 y van den Broek

L.A.M. et al. en Biotechnology Letters, 21 (5) , (1999) 441-445, dan a conocer una secuencia de α-galactosidasa de Bifidobacterium adolescentis.

"Glucósido hidrolasa, clon GH-D” de la base de datos UniProt [Online] de 27 de septiembre de 2005, XP002431985 recuperada del nº de acceso a EBI UNIPROT: Q40Z83, nº de acceso a la base de datos Q40Z83, da a conocer una secuencia de glucósido hidrolasa.

Scalabrini P. et al. en J. Food Microbiology, 39 (3) , (1998) , 213-219 describen el análisis en cepas de Bifidobacterium de su actividad α-galactosidasa y de la producción de ácidos láctico y acético para determinar su potencial para uso en la producción de leche de soja fermentada.

Van Laere V.M.J. et al. en Applied Microbiology and Biotechnology, 52 (5) , (1999) , 681-688 describen una αgalactosidasa de Bifidobacterium adolescentis.

Lamoureux L et al. en J. Dair y Science, 85 (5) , (2002) , 1058-1069 describen la producción de oligosacáridos en yogur que contiene bifidobacterias y cultivos de yogur.

Se ha encontrado que una cepa de Bifidobacterium bifidum es capaz de producir una actividad de enzima galactosidasa que convierte la lactosa en una mezcla novedosa de galactooligosacáridos que contiene inesperadamente un 35% de disacáridos que incluyen galabiosa (Gal (α1-6) -Gal) . Este disacárido es conocido (véanse Paton, J.C. y Paton, A.W. (1998) , Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989) , Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) por ser un antiadhesivo capaz de evitar la adhesión de toxinas, por ejemplo toxina Shiga y patógenos tales como E. coli, a la pared del intestino.

Esta cepa de B. bifidum se depositó con el número de acceso NCIMB 41171 en la National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, RU el 31 de marzo de 2003. Se describe también en la patente de RU nº 2.412.380.

Se ha encontrado que esta cepa de B. bifidum produce una α-galactosidasa que es capaz de convertir melibiosa en disacáridos de α-galactobiosa.

Según la invención, se proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia aminoacídica como se da en la in SEQ. ID NO: 2. La secuencia de ADN se da en SEQ. ID NO: 1.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una enzima codificada por una secuencia de ADN como se define anteriormente. Dicha enzima puede comprender la secuencia aminoacídica dada en SEQ. ID NO: 2.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector recombinante, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN como se define anteriormente. Dicho vector puede incorporarse a una célula hospedadora tal como una célula bacteriana, de levadura o fúngica. Como alternativa, la secuencia de ADN puede incorporarse a dicha célula hospedadora. Puede seleccionarse una célula hospedadora adecuada de Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus o Bacillus, por ejemplo Bacillus subtilis o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger.

Usando melibiosa como sustrato, la enzima codificada por la secuencia de ADN como se define anteriormente produce una mezcla de oligosacáridos, en particular disacáridos de α-galactobiosa.

La enzima o la célula hospedadora como se describe anteriormente pueden usarse para producir disacáridos de αgalactobiosa, que pueden formar parte de un producto para mejorar la salud intestinal. Dicho producto puede seleccionarse del grupo consistente en productos lácteos (por ejemplo, leche líquida, leche desecada en polvo tal como leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, leche en polvo enriquecida con grasas, suero en polvo, leche para lactantes, leche de continuación, helado, yogur, queso y productos lácteos fermentados) , bebidas tales como zumo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, repostería, pasteles, suplementos alimentarios, suplementos dietéticos, productos comestibles prebióticos, productos comestibles prebióticos, piensos animales, piensos para aves o incluso cualquier otro alimento o bebida.

Como alternativa, los disacáridos así producidos pueden usarse para la preparación de un medicamento, por ejemplo en forma de comprimido o cápsula, para evitar la adhesión de patógenos o toxinas producidas por

patógenos a la pared intestinal. El medicamento puede administrarse a un paciente, por ejemplo, después de un ciclo de tratamiento antibiótico, que a menudo altera o incluso destruye la flora intestinal sana normal.

Según un aspecto adicional más de la invención, se proporciona un proceso para producir una enzima como se define anteriormente que comprende cultivar una célula hospedadora como se define anteriormente en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de la enzima y la recuperación de la enzima o productos enzimáticos resultantes del cultivo.

La invención está también dirigida a un proceso para producir disacáridos de galactobiosa que comprende poner en contacto la enzima como se define anteriormente o una célula hospedadora como se define anteriormente con un material que contiene melibiosa en condiciones que conduzcan a la formación de los disacáridos.

El material que contiene melibiosa adecuado puede seleccionarse de melibiosa, rafinosa, estaquiosa 35 comercialmente disponibles o como un extracto de soja.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra la... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia aminoacídica como se da en SEQ. ID. NO: 2.

2. La secuencia de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia se da en SEQ. ID NO: 1.

3. Una enzima codificada por una secuencia de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una enzima que comprende una secuencia aminoacídica según SEQ. ID NO: 2.

5. Una α-galactosidasa que tiene la secuencia definida en SEQ. ID NO: 2.

6. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ADN de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

7. El vector según la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector de expresión.

8. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

9. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

10. La célula hospedadora según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula fúngica.

11. La célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que dicha célula se selecciona del grupo consistente en Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus y Aspergillus.

12. La célula hospedadora según la reivindicación 11, en la que la célula se selecciona del grupo consistente en Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans y Aspergillus niger.

13. Uso de una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula de una cualquiera de 20 las reivindicaciones 8 a 12, para producir disacáridos de α-galactobiosa.

14. Uso de una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para producir disacáridos de α-galactobiosa que son parte de un producto seleccionado del grupo consistente en productos lácteos tales como leche líquida, leche desecada en polvo, leche para lactantes, leche de continuación, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta,

alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, repostería, pasteles, suplementos alimentarios, suplementos dietéticos, productos comestibles prebióticos, productos comestibles prebióticos, piensos animales, piensos para aves y medicamentos.

15. Uso de una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 para producir un producto seleccionado del grupo consistente en productos lácteos tales como leche líquida, leche desecada en polvo, leche para lactantes, leche de continuación, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, repostería, pasteles, suplementos alimentarios, suplementos dietéticos, productos comestibles prebióticos, productos comestibles prebióticos, piensos animales, piensos para aves y medicamentos.

16. Un proceso para producir una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende cultivar una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de dicha enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.

17. Un proceso para producir un disacárido que comprende poner en contacto una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, con una solución de melibiosa.