BETA-GALACTOSIDASA CON ACTIVIDAD DE TRANSGALACTOSILACION.

Una secuencia de ADN que codifica una ß-galactosidasa, donde la secuencia se selecciona entre la secuencia dada en SEQ.

ID NO: 1 o de un fragmento o una degeneración de la misma, teniendo dicha degeneración una homología de 75% a 95%

ß-galactosidasa con actividad de transgalactosilación.

La presente invención se refiere a una nueva ß-galactosidasa con actividad de trans-galactosilación capaz de convertir lactosa en una mezcla de galacto-oligosacáridos. En particular se refiere a una ß-galactosidasa aislada a partir de una cepa recientemente descubierta de Bifidobacterium bifidum.

La invención se refiere particularmente a secuencias de ADN que codifican la nueva enzima ß-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por dicha secuencia de ADN y a la célula hospedadora que comprende la secuencia de ADN o que contiene un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención se refiere también al uso de la enzima codificada por una secuencia de ADN, o la célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN o el vector recombinante, para producir los galacto-oligosacáridos.

La bifidobacterias colonizan de forma natural el tracto intestinal inferior, un medio que es pobre en mono y disacáridos ya que tales azucares se consumen con preferencia por los huéspedes y microbios presentes en el tracto intestinal superior. Para sobrevivir en el tracto intestinal inferior las bifidobacterias producen varios tipos de exo y endoglicosidasas unidas a la superficie y/o en formas extracelulares, mediante las cuales pueden utilizar diversos hidratos de carbono.

Además de la actividad hidrolasa, algunas enzimas de las bifidobaterias muestran actividad transferasa. Esta actividad de trans-galactosilación de las glicosidasas se usa ampliamente para la síntesis enzimática de diversos oligosacáridos, que han demostrado que actúan como factores que promueven el crecimiento de las bifidobacterias.

Se sabe que algunas bifidobacterias producen enzimas ß-galactosidasas que están involucradas en el metabolismo bacteriano de la lactosa. En Møller, P. L. et al in Appl & Environ. Microbial., (2001), 62, (5), 2276-2283 se describe el aislamiento y caracterización de tres genes de ß-galactosidasa de una cepa de Bifidobacterium bifidum. Se encontró que los tres tipos de ß-galactosidasas eran capaces de catalizar la formación de beta galacto-oligosacáridos por trans-galactosilación.

En Durmortier et al en Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123 se describió la formación de beta oligosacáridos por una reacción de trans-galactosilación durante la hidrólisis de lactosa con Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Su análisis de la estructura de la mezcla de los oligosacáridos producidos mostró que las uniones eran enlaces ß-(1rightarrow3), ß-(1rightarrow6) y ß-(1rightarrow4)-D-galactosil. Durmortier sugirió que los compuestos producidos por Bifidobacterium bifidum están involucrados en las adherencia de la bacteria en el intestino grueso.

La patente WO01/90317 describe una nueva ß-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum, en particular una versión truncada de la enzima que tiene una actividad de trans-galactosilación alta.

Se ha encontrado una cepa de Bifidobacterium bifidum que es capaz de producir una actividad de enzima galactosidasa que convierte la lactosa en una nueva mezcla de galacto-oligosacáridos que contiene inesperadamente hasta un 35% de disacáridos que incluyen galabiosa (Gal (a 1-6)- Gal). Este disacárido es conocido (véase Paton, J C. Paton, A W (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K A (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) por ser un antiadhesivo capaz de evitar la adhesión de toxinas como la toxina Shiga y patógenos como E. coli, a la pared del intestino.

La cepa de B bifidum fue depositada con el numero de acceso NCIMB 41171 en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (Nacional Collection of Industrial & and Marine Bacteria), Aberdeen, Reino Unido el 31 de Marzo de 2003. También está descrita en la patente de Reino Unido GB2412380.

Actualmente se ha encontrado que esta cepa de B bifidum produce varias ß-galactosidasas, incluyendo una ß-galactosidasa nueva. Esta enzima produce una serie de oligosacáridos diferentes que tienen uniones ß.

Según la invención se proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos según la secuencia SEQ.ID NO: 2. La secuencia de ADN viene dada por la SEQ. ID NO: 1 o puede comprender un fragmento o degeneración de la misma.

Por "degeneración" se entiende una secuencia de ADN que presenta de 75 a 95% de homología.

Esta secuencia de ADN puede comprender substituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos que den como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos según la SEQ. ID NO: 2 inferior a un 25%. Las substituciones de nucleótidos pueden producir como resultado sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Según un segundo aspecto de la invención se proporciona una enzima codificada por una secuencia de ADN definida anteriormente. Tal enzima puede comprender la secuencia de aminoácidos dada en SEQ. ID NO: 2 o un fragmento de la misma.

Según un tercer aspecto de la invención se proporciona un vector recombinante, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN definida anteriormente. Este vector se puede incorporar en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana, levadura u hongo. Alternativamente, la secuencia de ADN puede ser incorporada en dicha célula hospedadora. Se puede seleccionar una célula hospedadora adecuada del grupo que comprende Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus por ejemplo Bacillus subtilus o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus por ejemplo Aspergillus níger.

Utilizando lactosa como substrato, la enzima codificada por la secuencia de ADN definida anteriormente produce una mezcla de oligosacáridos, que comprende disacáridos, como Gal (ß1-3) Glc, Gal (ß1-3) Gal, Gal (ß1-6) Gal y Gal (a1-6) Gal, trisacáridos y tetrasacáridos como Gal (ß1-6) Gal (ß1-4) Glc, Gal (ß1-3) Gal (ß1-4) Glc y Gal (ß1-6) Gal (ß1-6) Gal (ß1-4) Glc.

La enzima o la célula hospedadora descrita anteriormente puede usarse para producir una mezcla de galacto-oligosacáridos que puede formar parte de un producto para mejorar la salud intestinal. Dicho producto puede seleccionarse del grupo que consiste en productos lácteos (por ejemplo leche líquida, leche en polvo seca tal como la leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, leche desnatada enriquecida en grasa en polvo, suero de leche en polvo, leches infantiles, leche maternizada, helados, yogur, queso, productos de leche fermentada), bebidas tales como el zumo de fruta, los alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, alimentos para animales, alimentos para aves o por supuesto cualquier otro alimento o bebida. La presencia de galacto-oligosacáridos en dichos productos tiene la ventaja de incrementar el crecimiento de las Bifidobacterium promotoras de la salud en el producto o en la flora intestinal del consumidor después de la ingesta del producto o en ambos.

Alternativamente, los oligosacáridos producidos así pueden utilizarse para la preparación de un medicamento, por ejemplo en forma de comprimido o de cápsula, para evitar la adhesión de los patógenos o de las toxinas producidas por los patógenos a la pared del intestino. El medicamento puede ser administrado al paciente, por ejemplo después de un tratamiento con antibióticos, que a menudo altera o destruye la flora intestinal normal sana.

Según aún otro aspecto de la invención se proporciona un proceso para producir una enzima tal y como se define anteriormente que comprende cultivar una célula hospedadora definida anteriormente en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de la enzima y recuperar la enzima resultante o los productos enzimáticos del cultivo.

La invención también esta dirigida a un proceso para producir la mezcla de galacto-oligosacáridos que comprende poner en contacto la enzima definida anteriormente con un material que contenga lactosa en condiciones que conduzcan a la formación de la mezcla de galacto-oligosacáridos.

El material adecuado que contenga lactosa puede seleccionarse entre lactosa comercial, leche entera, leche semidesnatada, leche desnatada, suero de leche, leche desnatada enriquecida en grasa y suero de leche filtrado. Estos productos lácteos pueden obtenerse de vacas, búfalas, ovejas o cabras. La leche desnatada...

1. Una secuencia de ADN que codifica una ß-galactosidasa, donde la secuencia se selecciona entre la secuencia dada en SEQ. ID NO: 1 o de un fragmento o una degeneración de la misma, teniendo dicha degeneración una homología de 75% a 95%.

2. La secuencia de ADN según la reivindicación 1, donde dicha secuencia comprende sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos que tienen como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos según la SEQ. ID NO: 2 inferior al 25%.

3. Una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde dicha secuencia comprende sustituciones de nucleótidos que tienen como resultado substituciones de aminoácidos conservadoras.

4. Una enzima ß-galactosidasa codificada por una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una enzima ß-galactosidasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ. ID NO:2.

6. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. El vector según la reivindicación 6, donde dicho vector es un vector de expresión.

8. Una célula hospedadora que es una célula de levadura, una célula de hongo o una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus y Aspergillus que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7.

10. La célula hospedadora según la reivindicación 8 o reivindicación 9, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus circulans y Aspergillus Níger.

11. Uso de una enzima de la reivindicación 4 o reivindicación 5, o de una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir una mezcla de oligosacáridos.

12. Uso de una enzima de la reivindicación 4 o reivindicación 5, o una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir una mezcla de oligosacáridos que sea parte de un producto seleccionado del grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seca, leches infantiles, leche maternizada, helado, yogur, queso, productos de leche fermentada, bebidas tales como zumo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos para aves y medicamentos.

13. Uso de una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir un producto seleccionado del grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seca, leches infantiles, leche maternizada, helado, yogur, queso, productos de leche fermentada, bebidas tales como zumos de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos para aves y medicamentos.

14. Un proceso para producir una enzima de la reivindicación 4 o reivindicación 5, que comprende cultivar una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permita la expresión de dicha enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.