Alérgenos recombinantes con reducción de la unión a IgE sin disminución de la antigenicidad para células T.

Una variante recombinante del alergeno proteico Lol p 5 compuesta por las secuencias de aminoácidos de SECID N.

º 1 portadoras de las mutaciones seleccionadas entre el grupo compuesto por:

a) K172N, F173L, T174A y V175A (mut 4),

b) K57A, G273A, K275A, K172N, F173L, T174A y V175A (mut 6) y

c) K57A, ΔG272, K172A, F173L, T174A y V175A (mut 8).

Alergenos recombinantes con reducción de la unión a IgE sin disminución de la antigenicidad para células T.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En este documento se describen reactivos útiles en el tratamiento inmunoterapéutico o inmunoprofiláctico de enfermedades alérgicas. Más especialmente, la presente invención proporciona alergenos modificados que muestran una reducción de la capacidad de interacción con la IgE, incluyendo reducción de la actividad estimuladora de la producción de IgE, al tiempo que retiene la antigenicidad para las células T, lo que es útil en la inmunomodulación de las enfermedades alérgicas de tipo I. La presente invención además contempla un procedimiento de inmunomodulación de enfermedades alérgicas, como las enfermedades alérgicas de tipo I, mediante la administración de alergenos modificados que muestran una reducción de la capacidad de interacción con la IgE reteniendo la antigenicidad para las células T.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los detalles bibliográficos de las referencias proporcionadas en la presente memoria descriptiva se enumeran al final de la misma.

La referencia a cualquier técnica previa en esta memoria descriptiva no es, ni debe tomarse como tal, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que dicha técnica previa forme parte del conocimiento general común en cualquier país.

Las enfermedades alérgicas de tipo I, como la rinitis alérgica estacional, conjuntivitis, asma alérgica y dermatitis alérgica, representan un problema sanitario importante en los países industrializados (Wuthrich, Int. Arch. Allergy Immunol. 90: 3-10, 1989) . Se estima actualmente que el 15-20% de la población de los países desarrollados padece alguna forma de alergia (Miyamoto, Advances in Allergology and Clinical Immunology. Godard P, Bousquet J, Michel FB (eds.) pág. 343-347. The Parthenon Publishing Group, Cornforth, Reino Unido, 1992) . Por tanto, el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades se ha convertido en punto de interés para la investigación científica.

Las bases inmunológicas y bioquímicas principales de las reacciones alérgicas de tipo I son la interacción de sustancias alergénicas (alergenos) con anticuerpos IgE unidos a receptores Fc de alta afinidad sobre la superficie de mastocitos y basófilos. Esta interacción da lugar al entrecruzamiento de los anticuerpos IgE específicos de alergeno que, a su vez, estimula una liberación inmediata y una producción en cascada de mediadores inflamatorios responsables de los síntomas alérgicos. Los alergenos están presentes en las partículas en suspensión como, por ejemplo, el polvo doméstico, en el polen de gramíneas, maleza y árboles, en las esporas de hongos y en la caspa animal.

En la actualidad, una forma de intervención terapéutica de las enfermedades alérgicas (como la rinitis, conjuntivitis y asma alérgica) supone la inyección del alergeno que se considera responsable de la respuesta alérgica. Esto se denomina tratamiento de hiposensibilización. Los extractos actualmente en uso para este procedimiento se preparan a partir de fuentes naturales y contienen, además de los alergenos, componentes como proteínas a las que los pacientes no son alérgicos.

El desarrollo de técnicas recombinantes ha proporcionado los medios para producir altos niveles de alergenos purificados con fines diagnósticos y terapéuticos. Sin embargo, el alto nivel de pureza de las preparaciones de alergenos recombinantes da lugar a índices anafilactogénicos altos incluso a dosis muy bajas. Por consiguiente, es necesaria una atención extrema cuando se administran a pacientes. Por tanto, se necesita desarrollar alergenos recombinantes con riesgo reducido de choque anafiláctico.

La principal causa externa de la rinitis alérgica estacional y del asma alérgica es el polen de gramíneas en suspensión (Smart y col., Int. Arch. Allergy Immunol. 7: 243-248, 1983) . Los calendarios de polen muestran que el polen de gramíneas es más abundante en primavera y al inicio del verano cuando florecen las gramíneas, que es cuando la incidencia del asma alérgica es máxima. Las fuentes más importantes de polen de gramíneas son los pastos agrícolas comunes que están ampliamente introducidos en todo el mundo, aunque varían con la temperatura y las zonas de clima tropical. En regiones de temperaturas frías, las gramíneas como el ballico, la poa común y la hierba timotea (todos pertenecientes a la subfamilia Pooideae) son de importancia clínica, mientras que en temperaturas cálidas y entornos subtropicales el polen de césped (subfamilia Chloridoideae) es la fuente más importante de alergenos. Los estudios más exhaustivos se han realizado en proteínas de polen de ballico y, en menor medida, en poa común y hierba timotea.

Los individuos sensibles a alergenos de una gramínea son, a menudo, sensibles a los de diversos otros géneros de gramíneas. Esto es especialmente cierto para los pólenes de gramíneas de las subfamilia Pooideae (Smith y col., «Analysis of r y e-grass pollen allergens using two dimensional electrophoresis and immunoblotting» En Kraft D (ed) , Molecular Biology and Immunology of Allergens, CRC Press, Boca Raton, FL, 1994) donde se ha demostrado la reactividad inmunológica cruzada en experimentos de inhibición usando un ensayo de unión a IgE, la prueba radioalergosorbente (RAST) . En estos experimentos, los extractos de polen de una gramínea eran capaces de inhibir la unión de IgE a extractos de otras gramíneas.

Los componentes alergénicos del polen de gramíneas pueden clasificarse en diferentes grupos según sus propiedades fisicoquímicas e inmunológicas. Los alergenos principales que inducen una reacción alérgica al polen de las gramíneas de poáceas son alergenos de los grupos 1 y 5, tanto según el criterio del número de pacientes alérgicos que responden al tratamiento como de cantidades relativas de unión de la IgE a los alergenos (Singh y col., 1991; supra) . En el caso del ballico perenne, Lolium perenne, los extractos de polen contienen más de 17 proteínas que tienen la capacidad de unirse a la IgE del suero de pacientes alérgicos al polen de gramíneas (Smith y col., 1993, supra) . Sin embargo, se ha demostrado que los alergenos de los grupos 1 y 5 juntos pueden inhibir en mayor grado la unión de IgE a los extractos de polen sin procesar (Bond y col., J. Allergy. Immunol. 91: 339, 1993) .

Lol p 5, una proteína de 28-33 kDa, es el segundo alergeno en prevalencia del ballico y causa alergia en el 85-90% de los individuos alérgicos al polen de gramíneas. La clonación molecular de los ADNc que codifican este alergeno del grupo 5 (Singh y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88: 1384- 1388, 1991; Ong y col., Gene 134: 235-240, 1993) han demostrado que Lol p 5 existe como una familia de homólogos pero con isoformas diferenciables que retienen sus reactividad con IgE incluso tras la separación en geles PAGE-SDS desnaturalizantes e inmunotransferencia (Singh y col., 1991, supra) .

Swoboda I. y col. describen formas hipoalergénicas del alergeno del polen del ballico Lol p 5 como candidatas para inmunoterapia (Swoboda I. y col., Int. Arch. Allerg. Immunol. 134: 1018-2438, 2001) . Suphioglu describe la base molecular de reconocimiento de IgE de Lol p 5 (Suphioglu C. y col., Mol. Immunol. 35: 293-305, 1998) y Blaher describe la identificación de epítopes de células T de Lol p 9 (Blaher B. y col., J. Allergy Clin. Immunol. 98: 124-132, 1996) . Burton describe el contacto con el receptor de células T y los restos de unión a MHC del epítope de células T del alergeno del ballico (Burton M. D. y col. Allergy Clin Immunol. 103: 255-61, 1999) y De Lalla describe la identificación de epítopes de células T en Lol p 5 mediante predicción de estructura por ordenador (Lalla De C. y col., J. Immunol. 163: 1725-1729, 1999) . Ong describe los epítopes antigénicos y alergénicos de Lol p 5b usando fragmentación de genes (Ong E. K. y col., Mol. Immunol. 32: 295-302, 1995) . En el documento WO95/06728 se describen péptidos de Lol p 5 que comprenden epítopes de células T y Swodoba describe mutantes de Lol p 5 con reducción de la capacidad de unión a IgE (Swodoba I. y col., Europ. J. Immunol. 32: 270-280, 2002) . Schramm describe la preparación de variantes de Phl p 5b con reducción de la capacidad de unión a IgE pero que no conservan la reactividad con células T mediante ingeniería genética del alergeno (Schramm G. y col., J. Immunol.

162: 2406-2414, 1999) y Muller describe epítopes de células T de alergenos (Muller W. D. y col., Allergologie 22: 455-459, 1999) . Wiedermann describe la inducción de tolerancia en mucosa con moléculas hipoalergénicas en un modelo murino de asma alérgica (Wiedermann U. y col., Int. Arch. Allerg.... [Seguir leyendo]

1. Una variante recombinante del alergeno proteico Lol p 5 compuesta por las secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º 1 portadoras de las mutaciones seleccionadas entre el grupo compuesto por:

a) K172N, F173L, T174A y V175A (mut 4) ,

b) K57A, G273A, K275A, K172N, F173L, T174A y V175A (mut 6) y

c) K57A, LG272, K172A, F173L, T174A y V175A (mut 8) .

2. La variante recombinante del alergeno de la reivindicación 1, que comprende un número de reducido de epítopes IgE y/o muestra una reducción en la capacidad de unión a IgE y/o muestra una reducción de la estimulación de producción de IgE manteniendo la antigenicidad para células T.

3. La variante recombinante del alergeno de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho alergeno proteico en forma natural se asocia con una enfermedad alérgica de tipo I en sujetos sensibilizados.

4. La variante recombinante del alergeno de la reivindicación 3, en la que la enfermedad alérgica de tipo I es sensibilidad al polen de ballico.

5. La variante recombinante del alergeno de la reivindicación 3, en la que dicho sujeto sensibilizado es un ser 15 humano, un primate, ganado, animal de experimentación o animal de compañía.

6. La variante recombinante del alergeno de la reivindicación 5, en la que dicho sujeto sensibilizado es un ser humano.

7. Una composición que comprende una variante recombinante del alergeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

8. Una variante recombinante del alergeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un método de tratamiento del cuerpo del ser humano o del animal mediante terapia.

9. Uso de una variante recombinante del alergeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la producción de un medicamento para su uso en un método para la profilaxis o tratamiento de una enfermedad alérgica.

Figura 3

NOMBRE SECUENCIA (5' 3')

D1 sent [SEC ID N.º:13] D1 comp [SEC ID N.º:14] D2 sent [SEC ID N.º:15] D2 comp [SEC ID N.º:16] D3 sent [SEC ID N.º:17] D3 comp [SEC ID N.º:18] D4 sent [SEC ID N.º:19] D4 comp [SEC ID N.º:20] D5 sent [SEC ID N.º:21] D5 comp [SEC ID N.º:22]

Figura 4

Ac Pacientes

Figura 5

Figura 6

Figura 7A

Figura 7B

Figura 7C