Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Corynebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento para expresar un gen usando la célula.

Un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC ID Nº 7.

Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Cor y nebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento para expresar un gen usando la célula

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Cor y nebacterium, a un casete de expresión que incluye el mismo, a un vector que incluye el casete de expresión, a una célula huésped que incluye el vector, y a un procedimiento para expresar un gen usando la célula huésped.

Técnica antecedente Las bacterias corineformes son microorganismos usados para producir diversos materiales químicos usado en muchas aplicaciones, tales como pienso animal, medicinas, y alimentos que incluyen L-lisina, L-treonina, y diversos ácidos nucleicos. Una cepa de bacterias corineformes que muestre alta productividad puede desarrollarse a través de ingeniería genética e ingeniería metabólica. Para obtener dicha cepa de bacterias corineformes que muestren alta productividad, tiene que expresarse un gen relacionado con diversas vías metabólicas en las bacterias corineformes. Para este fin, debe desarrollarse un promotor adecuado.

En líneas generales, en bacterias corineformes, un gen se expresa bajo un promotor incluido de forma inherente en el mismo (véase, por ejemplo, Journal of Bacteriology, 181 (19) , 6188-6191, 1999) . Sin embargo, la estructura de una secuencia promotora para expresar un gen en bacterias corineformes es desconocido, mientras que las estructuras de otros microorganismos industriales, tales como E. coli y Bacillus subtilis, son conocidas. Por lo tanto, se ha sugerido el siguiente procedimiento para producir promotores que posibiliten la expresión de un gen en bacterias corineformes. En primer lugar, se retira una región promotora de un gen que sea resistente a un antibiótico, tal como cloranfenicol. Por separado, se escinde un ADN cromosómico separado de bacterias corineformes usando una enzima de restricción adecuada, y el fragmento resultante se introduce en el gen a partir del cual se retiró la región promotora. Después, el gen obtenido se usa para transformar bacterias corineformes para producir una cepa transformada y se mide la resistencia a antibiótico de la cepa transformada (véase Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996.) . En particular, se ha desarrollado una cantidad muy pequeña de promotores usados en Cor y nebacterium ammoniagenes, un microorganismo que produce ácido nucleico conocido. Por ejemplo, se usa un promotor que tiene una actividad aproximadamente un 10 % mayor que un promotor tac en E. coli (véase, Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003.) . Sin embargo, cuando se usa en una expresión masiva de genes, dicho promotor muestra baja eficacia. La patente de Estados Unidos Nº 5.593.781 desvela un ADN promotor que se separa de una cepa de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) y tiene actividad mayor que un promotor tac. Sin embargo, dicho ADN promotor que se separa de un género Brevibacterium puede no ser funcional en otras bacterias. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar una secuencia promotora que se obtenga de Cor y nebacterium ammoniagenes disponible en el mercado, y tenga elevada actividad en otras bacterias.

Por consiguiente, los inventores de la presente invención buscaron una secuencia promotora potente en Cor y nebacterium ammoniagenes y hallaron que un promotor de acuerdo con la presente invención puede expresar genes con elevada actividad en Cor y nebacterium ammoniagenes.

Descripción de los dibujos La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de electroforesis bidimensional de una muestra extraída de una bacteria Cor y nebacterium ammoniagenes, en el que los resultados del ensayo se tiñeron de plata y se revelaron para la identificación; la Figura 2 ilustra un procedimiento para producir un vector de exploración de p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención; la Figura 3 ilustra un procedimiento para producir un vector recombinante que incluya la secuencia promotora pcj1 a pcj7 de un vector de exploración p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención Problema técnico La presente invención proporciona un promotor que tiene elevada actividad en Cor y nebacterium.

La presente invención también proporciona un casete de expresión que incluye el promotor y un vector que incluye el casete de expresión.

La presente invención también proporciona una célula huésped que incluye el vector.

La presente invención también proporciona un procedimiento para expresar un gen usando la célula huésped.

Solución técnica La presente invención proporciona un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC ID Nº 7.

El promotor de acuerdo con la presente invención es un ácido nucleico aislado y tiene actividad promotora. En el presente documento, el término "promotor" se refiere a una región de ADN a la cual se une una ARN polimerasa para iniciar la trascripción de un gen. El término "promotor tac" se refiere a un promotor obtenido fusionando una secuencia obtenida de la región - 35 de un promotor del operón de triptófano de E. coli y una secuencia obtenida de la región - 10 de un promotor del operón de lactosa de E. coli. Se sabe que el promotor tac tiene elevada actividad promotora. Un promotor que tenga al menos un ácido nucleico seleccionado entre las SEC ID Nº 1, 4, 5, 6 y 7 tiene mayor actividad en bacterias del género Cor y nebacterium que el promotor tac. En particular, un promotor que tiene al menos un ácido nucleico seleccionado entre las SEC ID Nº 1 y 4 tiene 10 veces mayor actividad que el promotor tac en bacterias del género Cor y nebacterium.

El promotor de acuerdo con una realización de la presente invención tiene actividad promotora en bacterias del género Escherichia, además de bacterias del género Cor y nebacterium.

La célula en la cual el promotor de la presente invención puede funcionar puede ser cualquier bacteria del género Cor y nebacterium. Ejemplos de bacterias del género Cor y nebacterium incluyen Cor y nebacterium ammoniagenes CJHB100 (KC-CM-10330) y ATCC 6871, Cor y nebacterium glutamicum ATCC 13032 y ATCC 13060, y similares. Sin embargo, las bacterias del género Cor y nebacterium no se limitan a las mismas. Ejemplos de bacterias del género Escherichia en las cuales puede funcionar un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención, incluyen E. coli.

La secuencia del promotor de acuerdo con una realización de la presente invención puede cambiarse fácilmente por un especialista en la técnica a través de un procedimiento de mutagénesis conocido, tal como evolución dirigida y mutagénesis dirigida al sitio. Por consiguiente, se incluye en el alcance de la presente invención un ácido nucleico que tiene, por ejemplo, un 70 % o más de homología, preferiblemente un 80 % o más de homología, y más preferiblemente, un 90 % o más de homología, con la secuencia promotora aislada que incluye al menos un ácido nucleico seleccionado entre la SEC ID Nº 7, y puede actuar como promotor en bacterias del género Cor y nebacterium.

La presente invención también proporciona un casete de expresión que incluye el promotor que está unido de forma funcional a una secuencia codificante. La secuencia codificante puede ser, por ejemplo, el gen completo o una secuencia codificante que codifica una región predeterminada del gen. En el presente documento, el término "unido de forma funcional" indica que la secuencia codificante está funcionalmente conectada al promotor de modo que la secuencia promotora pueda iniciar o mediar la trascripción de la secuencia codificante. El casete de acuerdo con una realización de la presente invención puede incluir adicionalmente secuencias de control 5' y 3' unidas de forma funcional a la secuencia promotora. La secuencia codificante puede ser un gen asociado con un producto metabólico, tal como IMP, GMP, L-lisina y L-treonina.

La presente invención también proporciona un vector que incluye el casete de expresión de acuerdo con una realización de la presente invención. En el presente documento, el vector no está limitado, y puede ser cualquier vector conocido en la técnica. Ejemplos del vector de acuerdo con realizaciones de la presente invención incluyen un vector pCR2.1-TOPO (producido en Invitrogen Inc., USA) y pECCG 117 (KFCC-10673) . Sin embargo, el vector no está limitado a los mismos. Ejemplos del vector que incluye el casete de expresión de acuerdo con una realización de la presente invención incluyen p117-cj1-gfp, p117-cj2-gfp, p117-cj3-gfp, p117-cj4-gfp,... [Seguir leyendo]

1. Un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC ID Nº 7.

2. Un casete de expresión, que comprende el promotor de la reivindicación 1 y está unido de forma funcional a una secuencia codificante.

3. Un vector que comprende el casete de expresión de la reivindicación 2.

4. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. La célula huésped de la reivindicación 4 que es una célula bacteriana que pertenece a un género Cor y nebacterium o un género Escherichia.

6. Un procedimiento para expresar un gen exógeno que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 10 o reivindicación 5.