VECTORES DE EXPRESIÓN PARA ESTIMULAR UNA RESPUESTA INMUNE Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LOS MISMOS.

Vectores de expresión para estimular una respuesta inmune y procedimientos de uso de los mismos Declaración de derechos sobre invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo con patrocinio federal La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno en virtud de la Subvención NIH Núm. AI-42699-01, Subvención NIH Núm. AI38584-03, y Contrato NIH Núm. N01-AI-45241. El Gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención. Campo de la invención La presente invención se refiere a vacunas de ácido nucleico que codifica múltiples epitopos CTL y HTL y secuencias dirigidas al MHC. Antecedentes de la invención Las vacunas son de importancia fundamental en la medicina moderna y han sido muy efectivas para combatir ciertas enfermedades humanas. Sin embargo, a pesar de la exitosa implementación de programas de vacunación que han limitado mucho o prácticamente eliminado varias enfermedades humanas debilitantes, existen numerosas enfermedades que afectan a millones en el mundo para las que no se han desarrollado vacunas efectivas. Los principales avances en el campo de la inmunología han llevado a una mayor comprensión de los mecanismos involucrados en la respuesta inmune y han provisto perspectivas para el desarrollo de nuevas estrategias de vacuna (Kuby, Immunology, 443-457 (3rd ed., 1997), que se incorporan en la presente memoria por referencia). Estas nuevas estrategias de vacuna han aprovechado el conocimiento obtenido con respecto a los mecanismos por los cuales el material extraño, denominado antígeno, es reconocido por el sistema inmune y eliminado del organismo. Una vacuna efectiva es una que estimula una respuesta inmune a un antígeno de interés. Las células especializadas del sistema inmunológico son responsables de la actividad protectora necesaria para combatir las enfermedades. Una respuesta inmune involucra dos grupos principales de células, linfocitos o leucocitos, y células que presentan antígeno. El fin de estas células de la respuesta inmune es reconocer el material extraño, tal como un organismo infeccioso o una célula cancerosa y eliminar este material extraño del organismo. Dos tipos principales de linfocitos median diferentes aspectos de la respuesta inmune. Las células B exhiben en su superficie celular proteínas especializadas, llamadas anticuerpos, que se unen específicamente al material extraño, llamado antígeno. Las células B efectoras producen formas solubles del anticuerpo, que circulan en todo el organismo y actúan para eliminar el antígeno del organismo. Esta rama del sistema inmunológico se conoce como la rama humoral. Las células B de memoria actúan para reconocer el antígeno en encuentros futuros al continuar expresando la forma del anticuerpo unida a membrana. Un segundo tipo principal de linfocitos es la célula T. Las células T también tienen en su superficie celular proteínas especializadas que reconocen el antígeno pero, en contraste con las células B, requieren que el antígeno se una a un complejo de proteína de membrana especializado, el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), en la superficie de una célula que presenta antígenos. Dos clases importantes de las células T, denominadas linfocitos T auxiliares ("HTL") y linfocitos T citotóxicos ("CTL"), a menudo se distinguen sobre la base de la presencia de la proteína CD4 o CD8, respectivamente, en la superficie celular. Esta rama del sistema inmunológico se conoce como rama mediada por células. La segunda clase importante de células de la respuesta inmune son células que actúan en la presentación del antígeno por procesamiento del antígeno para la unión a las moléculas de MHC expresadas en las células que presentan antígeno. El antígeno procesado que se une a las moléculas de MHC se transfiere a la superficie de la célula, en la que el complejo antígeno-MHC está disponible para unirse a las células T. Las moléculas de MHC se pueden dividir en moléculas de MHC de clase I y clase II y se reconocen por las dos clases de células T. Casi todas las células expresan las moléculas de MHC clase I, que actúan para presentar el antígeno a los linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T citotóxicos normalmente reconocen el antígeno unido a MHC clase I. Un subconjunto de células llamado células que presentan antígeno expresan moléculas de MHC clase II. Los linfocitos T auxiliares normalmente reconocen el antígeno unido a las moléculas de MHC clase II. Las células que presentan antígeno incluyen células dendríticas, macrófagos, células B, fibroblastos, células gliales, células pancreáticas beta, células epiteliales tímicas, células epiteliales tiroideas y células endoteliales vasculares. Estas células que presentan antígeno generalmente expresan las moléculas de MHC clase I y clase II. Asimismo, las células B actúan como células productoras de anticuerpo y que presentan antígeno. Una vez que un linfocito T auxiliar reconoce un complejo antígeno-MHC clase II en la superficie de una célula que presenta antígeno, el linfocito T auxiliar se activa y produce factores de crecimiento que activan una variedad de células involucradas en la respuesta inmune, que incluyen las células B y linfocitos T citotóxicos. Por ejemplo, bajo la influencia de los factores de crecimiento expresados por los linfocitos T auxiliares activados, se activa un linfocito T 2 E99924233 27-10-2011   citotóxico que reconoce un complejo de antígeno-MHC clase I. Los CTL controlan y eliminan células que exhiben el antígeno reconocido específicamente por los CTL, tales como células infectadas o células tumorales. En consecuencia, la activación de los linfocitos T auxiliares estimula la activación de las ramas mediada humoral y celular del sistema inmunológico. Un aspecto importante de la respuesta inmune, en particular relacionado con la eficacia de la vacuna, es la manera en que el antígeno se procesa de modo que pueda ser reconocido por las células especializadas del sistema inmunológico. Se utilizan distintas vías del procesamiento y presentación del antígeno. Una es una vía citosólica, que hace que el antígeno se una a las moléculas de MHC de clase I. Una vía alternativa es una vía del retículo endoplásmico, que bordea el citosol. Otra es una vía endocítica, que produce que el antígeno se una a las moléculas de MHC clase II. En consecuencia, la presentación en la superficie celular de un antígeno particular por una molécula de MHC clase II o clase I a un linfocito T auxiliar o un linfocito T citotóxico, respectivamente, es dependiente de la vía de procesamiento para este antígeno. La vía citosólica procesa antígenos endógenos que se expresan dentro de la célula. El antígeno es degradado por un complejo de proteasa especializado en el citosol de la célula, y los péptidos antigénicos resultantes se transportan en el retículo endosplásmico, una organela que procesa moléculas de la superficie celular. En el retículo endoplásmico, los péptidos antigénicos se unen a las moléculas de MHC de clase I, que posteriormente se transportan a la superficie celular para la presentación a los linfocitos T citotóxicos del sistema inmunológico. Los antígenos que existen fuera de la célula se procesan por la vía endocítica. Tales antígenos son tomados en la célula por endocitosis, que coloca los antígenos en vesículas especializadas llamadas endosomas y posteriormente en vesículas especializadas llamadas lisosomas, en las que el antígeno es degradado por las proteasas en péptidos antigénicos que se unen a las moléculas MHC clase II. El complejo de péptido antigénico-molécula de MHC clase II posteriormente se transporta a la superficie celular para la presentación a los linfocitos T auxiliares del sistema inmunológico. Se debe considerar una variedad de factores en el desarrollo de una vacuna efectiva. Por ejemplo, el grado de activación de la rama mediada humoral o celular del sistema inmunológico puede determinar la efectividad de una vacuna contra una enfermedad particular. Por otra parte, el desarrollo de la memoria inmunológica por la inducción de la formación de células de memoria puede ser importante para una vacuna efectiva contra una enfermedad particular (Kuby, supra). Por ejemplo, la protección de las enfermedades infecciosas causadas por patógenos con períodos de incubación cortos, tales como virus de la gripe, requiere altos niveles de anticuerpo neutralizante generados por la rama humoral debido a que los síntomas de la enfermedad ya están en proceso antes de que se active la memoria. En forma alternativa, la protección de las enfermedades infecciosas causadas por patógenos con períodos de incubación largos, tales como virus de polio, no requiere anticuerpos neutralizantes en el momento de la infección pero en cambio requiere células B de memoria que puedan generar los anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia dirigida del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) fusionado a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica dos o más epitopos del péptido heterólogo, en el que los epitopos del péptido heterólogo comprenden dos epitopos del péptido VIH (HTL) restringido de clase II o un epitopo del péptido VIH (CTL) restringido de clase I y un epitopo del péptido (HTL) restringido de clase II, en el que al menos uno de dichos epitopos del péptido VIH (HTL) restringido de clase II se selecciona del grupo de péptidos provisto en la Tabla 5; y en el que además dicho epitopo del péptido VIH (CTL) restringido de clase I se selecciona del grupo de péptidos provisto en la Tabla 6 2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que los epitopos del péptido heterólogo comprenden dos o más epitopos del péptido VIH (HTL) restringido de clase II heterólogo. 3. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que los epitopos del péptido heterólogo comprenden un epitopo del péptido VIH (CTL) restringido de clase I y un epitopo del péptido (HTL) restringido de clase II. 4. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que los epitopos del péptido heterólogo además comprenden uno o más epitopos del péptido VIH (CTL) restringido de clase I. 5. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que los epitopos del péptido heterólogo además comprenden dos o más epitopos del péptido VIH (CTL) restringido de clase I. 6. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que los epitopos del péptido heterólogo además comprenden dos o más epitopos del péptido VIH (HTL) restringido de clase II. 7. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que los epitopos del péptido heterólogo además comprenden un epitopo del péptido VIH (HTL) restringido de clase II universal. 8. El vector de expresión de la reivindicación 3 o 7, en el que el epitopo del péptido VIH (HTL) restringido de clase II universal es un epitopo pan DR. 9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en el que el epitopo pan DR tiene la secuencia AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeu-LysAlaAlaAla (SEQ ID NO:38). 10. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que la secuencia dirigida a MHC comprende una región de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en la proteína II, LAMP-I, HLS-DM, HLA-DO, H2-DO, proteína de la matriz de la gripe, antígeno de superficie de hepatitis B, antígeno del núcleo de hepatitis B, partícula Ty, proteína Ig, proteína Ig-ß, y secuencia señal de la cadena kappa de Ig. 11. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el vector de expresión también comprende un segundo promotor unido operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica uno o más epitopos del péptido (HTL) restringido heterólogo de clase II o epitopos del péptido (CTL) restringido de clase I. 12. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el vector comprende pMin.1 o pEP2, enunciados en las SEQ ID NOs: 38 y 35, respectivamente. 13. El vector de expresión de la reivindicación 3 o 4, en el que el epitopo del péptido (CTL) restringido de clase I comprende un motivo estructural para un supertipo HLA, por el cual el epitopo del péptido (CTL) restringido de clase I se une a dos o más miembros del supertipo con una afinidad mayor que 500 nM. 14. El vector de expresión de la reivindicación 4 o 5, en el que los epitopos del péptido (CTL) restringido de clase I tienen motivos estructurales que proporcionan afinidad de unión para más de un supertipo de alelo de HLA. 15. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para su uso en un procedimiento de inducir una respuesta inmune en un sujeto mamífero. 16. Un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia dirigida al complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) fusionada a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un epitopo del péptido de VIH (HTL) restringido de clase II heterólogo humano, en el que dicho epitopo del péptido de VIH (HTL) restringido de clase II del péptido de VIH se selecciona del grupo que consiste en: AETFYVDGAANRETK, EKVYLAWVPAHKGIG, EVNIVTDSQYALGII, FRKYTAFTIPSINNE, 46 E99924233 27-10-2011   GAVVIQDNSDIKVVP, GEIYKRWIILGLNKI, HSNWRAMASDFNLPP, IKQFINMWQEVGKAMY, KRWIILGLNKIVRMY, KTAVQMAVFIHNFKR, KVYLAWVPAHKGIGG, QGQMVHQAISPRTLN, QHLLQLTVWGIKQLQ, QKQITKIQNFRVYYR, SPAIFQSSMTKILEP, WAGIKQEFGIPYNPQ, WEFVNTPPLVKLWYQ, y YRKILRQRKIDRLID para su uso en un procedimiento de inducir una respuesta inmune in vivo que comprende administrar dicho vector de expresión a un sujeto mamífero. 17. El vector de expresión de la reivindicación 16, en el que la segunda secuencia de nucleótidos además comprende dos o más epitopos del péptido VIH (HTL) restringido de clase II heterólogo. 18. El vector de expresión de la reivindicación 16, en el que la segunda secuencia de nucleótidos también comprende uno o más epitopos del péptido VIH (CTL) restringido de clase I heterólogo. 19. El vector de expresión de la reivindicación 16, en el que la segunda secuencia de nucleótidos también comprende un epitopo del péptido (HTL) restringido universal de clase II. 20. El vector de expresión de la reivindicación 19, en el que el epitopo del péptido VIH (HTL) restringido de clase II universal es un epitopo pan DR. 21. El vector de expresión de la reivindicación 20, en el que el epitopo pan DR tiene la secuencia AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeu-LysAlaAlaAla (SEQ ID NO:38). 22. El vector de expresión de la reivindicación 16, en el que la secuencia dirigida a MHC comprende una región de un polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la proteína II, LAMP-I, HLS-DM, HLA-DO, H2-DO, proteína de la matriz de la gripe, antígeno de superficie de hepatitis B, antígeno del núcleo de hepatitis B, partícula Ty, proteína Ig-, proteína Ig-ß, y secuencia señal de la cadena kappa de Ig. 23. El vector de expresión de la reivindicación 16, en el que el vector de expresión también comprende una segunda secuencia promotora unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica uno o más epitopos del péptido (HTL) restringido heterólogo de clase II o (CTL) restringido de clase I. 24. El vector de expresión de la reivindicación 18, en el que el epitopo del péptido (CTL) restringido de clase I comprende un motivo estructural para un supertipo HLA, por el cual el epitopo del péptido se une a dos o más miembros del supertipo con una afinidad mayor que 500 nM. 25. El vector de expresión de la reivindicación 18, en el que los epitopos del péptido (CTL) restringido de clase I tienen motivos estructurales que proporcionan afinidad de unión para más de un supertipo de alelo de HLA. 47 E99924233 27-10-2011   48 E99924233 27-10-2011   49 E99924233 27-10-2011   E99924233 27-10-2011   51 E99924233 27-10-2011   52 E99924233 27-10-2011   FIG 5 53 E99924233 27-10-2011   FIG 6 54 E99924233 27-10-2011   FIG 7 E99924233 27-10-2011   FIG 7 continuación 56 E99924233 27-10-2011   FIG 8 57 E99924233 27-10-2011   FIG 8 Continuación 58 E99924233 27-10-2011   FIG. 9 59 E99924233 27-10-2011   FIG 10 E99924233 27-10-2011   FIG 11 61 E99924233 27-10-2011   FIG 12 62   FIG 12 Continuación 63   FIG 13 64   FIG 13 Continuación   FIG 13 Continuación 66   FIG 14 67   FIG 14 Continuación 68   FIG 15 69   FIG 15 Continuación   FIG 16 71   FIG 16 Continuación 72   FIG 17 73   FIG 17 Continuación 74   FIG 18   FIG 19 76   FIG 19 Continuación 77   FIG 19 Continuación 78   FIG 19 Continuación 79   FIG 19 Continuación   FIG 19 Continuación 81   FIG 19 Continuación 82   FIG 19 Continuación 83   FIG 20 84   FIG 21   FIGURA 22 86   FIGURA 23 87   FIGURA 24 88   FIGURA 25 89