Vectores AAV para terapia genética in vivo de artritis reumatoide.

Virión rAAV comprendiendo proteínas cápsidas de serotipo AAV, por el cual el virión rAAV comprende un vectorrAAV2 comprendiendo un elemento de expresión operativamente unido a una secuencia de ácidos nucleicos quecodifica una proteína terapéutica eficaz contra la artritis reumatoide.

Vectores AAV para terapia genética in vivo de artritis reumatoide Campo de la invención [0001] La presente divulgación se refiere al campo de terapia genética basada en virus adeno-asociados (AAV) , en particular, terapia genética in vivo de artritis reumatoide (AR) . La descripción proporciona viriones recombinantes AAV que son altamente eficaces en la entrega de genes que codifican proteínas terapéuticas, tales como proteínas antiinflamatorias o proteínas que inhiben actividad NF-KB, en las articulaciones, y métodos para uso de tales viriones en terapia genética in vivo y ex vivo.

Antecedentes de la invención [0002] La artritis reumatoide (AR) es un trastorno destructivo progresivo que se dirige principalmente a las articulaciones y se caracteriza por la hiperproliferación de tejido sinovial y la infiltración de células derivadas de sangre dando como resultado la erosión progresiva del cartílago y del hueso. La incidencia de AR ha sido proporcionada para ser alrededor de 30 por 100.000 población, y esta puede afectar a cualquier grupo de edad desde niños a ancianos. La prevalencia de la enfermedad es aproximadamente 1 por ciento a nivel mundial. Así, hay aproximadamente 150.000 pacientes de AR solo en los Países Bajos. El pico de aparición está entre las edades de 30 y 55 y, debido a los índices consistentemente más altos en mujeres, la prevalencia de AR en mujeres sobre 65 años es hasta 5 por ciento.

AR se asocia con un alto grado de pérdida económica, morbilidad y mortalidad temprana. Como ejemplo, casi un 80 por ciento de pacientes en un centro fueron seriamente discapacitados después de 2 años de seguimiento; un tercero adicional murió. Pacientes con AR que requieren cuidado hospitalario han aumentado al menos dos veces la mortalidad cuando se compara con normales, y AR más severa se une con índices de mortalidad más altos. El exceso de mortalidad en la AR severa se ha comparado con arteriopatía coronaria de tres vasos o fase IV de enfermedad de Hodgkin.

Una apreciación de los mecanismos patógenos de AR y los malos resultados con terapia convencional ha llevado al concepto reciente de tratamiento agresivo de enfermedad temprana o recién diagnosticada para suprimir inflamación en curso y prevenir herida en la articulación. Terapia con fármacos es el soporte principal de tratamiento para todos los pacientes salvo aquellos en remisión clínica. Tal terapia debería ser instituida con los objetivos de tratar a cada paciente suficientemente para inducir una remisión y prevención de otras pérdidas de tejidos de articulaciones o función en actividades diarias. Además de terapia convencional con fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad, métodos nuevos dirigidos a bloqueo de TNF-a se han introducido exitosamente en clínica. Es ahora posible alcanzar 20% de mejora en aproximadamente 70% de pacientes de AR usando este método. La mayoría de este 20 % de respondedores de la American College of Rheumatology (ACR) , no obstante, todavía tendrán algunas articulaciones inflamadas activamente. Aproximadamente, 30% de los pacientes no responderá a bloqueo de TNF-a con respecto a actividad de artritis.

Corticosteroides intra-articulares son un soporte principal importante del tratamiento de sinovitis sintomática en pacientes con AR. Especialmente cuando hay actividad de artritis aislada bajo terapia sistémica antirreumática, como puede ocurrir en más pacientes, hay una indicación para tratamiento local. No obstante, no todos los pacientes respondes al uso de corticosteroides y su uso se limita por efectos secundarios.

La patología de AR se extiende en toda la conexión sinovial. A diferencia de la naturaleza acelular de líquido sinovial normal, líquido sinovial de AR se enriquece predominantemente con neutrófilos, pero macrófagos, linfocitos T y células dendríticas están también presentes (Tak, P.P. Examination of the synovium and synovial fluid. En: Firestein GS, Panayi GS, Wollheim FA, editors. Rheumatoid arthritis. Frontiers in pathogenesis and treatment. New York: Oxford University Press, Inc., 2000: 55- 68) . El aumento en la celularidad es más obvio en la membrana sinovial, que se vuelve infiltrada por células reclutadas de la sangre. El estrato de revestimiento de la articulación aumenta de 1-2 células a 6-8 células de grueso y consiste principalmente en macrófagos íntimos activados y sinoviocitos tipo fibroblasto. Alteraciones en la biología normal de sinoviocitos son importantes en el desarrollo y mantenimiento del proceso de patológico asociado a AR, incluyendo invasión y destrucción de cartílago articular y del hueso. Además de la producción de mediadores solubles tales como elastasa y colagenasa, sinoviocitos median este proceso patofisiológico por la expresión de proteínas de superficie celular, que se implica en el reclutamiento y activación de linfocitos y macrófagos dentro de sinovial reumatoide. Sinoviocitos se pueden alcanzar fácilmente vía el espacio intra-articular, son relativamente longevos, y así representan un objetivo ideal para estrategias de terapia de gen (Chernajovsky, Y. et al., 1998, Drug Aging 12:29-41; Robbins, P. D. et al., 1998, Springer Semin. Immunopathol. 20:197-209) .

Además, la naturaleza localizada de la conexión hace la terapia genética in vivo muy atractiva. Muchas interacciones moleculares y celulares en la sinovial reumatoide se mantienen y se modulan por citocina. Un hallazgo consistente en la AR ha sido la abundancia de citocinas derivadas de macrófago y de fibroblasto proinflamatorias tales como IL-1, TNF-a, y IL-18 en la sinovial reumatoide. Los inhibidores de origen natural IL-1 y TNF-a, antagonista receptor de IL-1 (IL-1RA) y los receptores solubles TNF-a p55 y p75 se producen en paralelo con sus duplicados. Para IL-18 un

proteína de enlace IL-18 se purifica. Terapias que proveen exceso de inhibidores de citocina recombinantes pueden desviar el equilibrio en la AR hacia un estado anti-inflamatorio. Eficacia clínica de métodos dirigidos de anti-TNF-a y anti-IL-1 destacan que citocinas determinadas son objetivos apropiados para terapia genética. Otro método podría ser la sobreexpresión dirigida de proteínas anti-inflamatorias biológicamente activas (p. ej. IL-4; IL-10; IL-13, y IFN-a) por sinoviocitos para inhibir la cascada inflamatoria (Boyle, D. L. et al., 1999, Gene Ther. 6:1911-1918) .

NF-KB es claramente uno de los reguladores de expresión de gen proinflamatorio más importante (Tak, P. P. and Firestein, G. S., 2001, J. Clin. Invest. 107 (1) : 7-11) . Síntesis de citocinas, tal como TNF-a, IL-1º, IL-6, y IL-8 se media por NF-KB, como es la expresión de Cox-2. Aupperle et al. (1999, J. Immunol. 163: 427-433) estudió recientemente la función de IKK en sinoviocitos primarios aislados tipo fibroblasto de sinovial de pacientes con AR y osteoartritis. En ambos grupos, proteína inmunoreactiva IKK es abundante en estas células, y IKK-a y IKK-º son constitutivamente expresadas en el nivel AR. La función IKK en estas células puede ser mucho mayor por de TNF-a y IL-1, conduciendo a degradación de endógeno IKB-a y translocación nuclear de NF-KB. Activación de esta vía y la inducción consecuente de IL-6, IL-8, ICAM-1, y expresión de colagenasa-1, dependen específicamente de IKK-º (Aupperle, K. R. et al., 1999, J. Immunol. 163: 427-433) . Así, transfección con construcciones adenovirales que codifican un IKK-º dominante negativo mutante impide translocación TNF-a mediada NF-KB nuclear y expresión genética proinflamatoria en sinoviocitos, mientras que IKK-a dominante negativo mutante no tiene ningún efecto (Aupperle, K. R. et al., 1999, J. Immunol. 163: 427-433) .

Modelos animales de artritis inflamatoria sostienen la noción de que la activación de NF-KB juega un papel patógeno in vivo. Por ejemplo, unión sinovial aumentada de NF-KB precede al desarrollo de implicación clínica de articulación en la artritis inducida por colágeno murina y gradualmente aumenta durante la evolución de enfermedad (Han, Z. N., et al. 1998, Autoimmunity 28: 197-208) . Mucha de esta actividad de unión parece ser debida a p50, que ha sido implicado en transcripción de colagenasa-3 y podría contribuir, con AP-1 localmente activado, para resorción de matriz extracelular. Activación sinovial NF-KB también ocurre dentro de unos días después de inmunización en la artritis adyuvante de rata (Tsao, P. W. et al. 1997, Clin. Immunol. Immunopathol. 83: 173-178) . Activación selectiva de NF-KB en ratas normales por transferencia intra-articular de un gen IKK-º funcional, conduce a inflamación sinovial y señales clínicas de artritis (Tak, P. P. et al., 2001, Arthritis Rheum.... [Seguir leyendo]

1. Virión rAAV comprendiendo proteínas cápsidas de serotipo 5 AAV, por el cual el virión rAAV comprende un vector rAAV2 comprendiendo un elemento de expresión operativamente unido a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína terapéutica eficaz contra la artritis reumatoide.

2. Virión rAAV según la reivindicación 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste en: inhibidor de IL-1, inhibidor de TNFa, antagonista del receptor de IL-1, proteína de enlace de IL-18, receptor de sTNFa p55 o sTNFa p75; dn-IKK-13, IL-4; IL-10; IL-13, IFN-º y VIP, y variantes de estos teniendo al menos 80% de identidad de secuencia.

3. Método in vitro para administración de virión rAAV de técnica según la reivindicación 1 o 2 a células sinoviales o cultivos de células comprendiendo células sinoviales ex vivo, donde las células transducidas son opcionalmente seleccionadas.

4. Célula transducida sinovial obtenible por el método según la reivindicación 3.

5. Composición farmacéuticamente aceptable comprendiendo un virión recombinante AAV tal y como se define en la reivindicación 1 o 2 o una célula sinovial transducida tal y como se define en la reivindicación 4, comprendiendo además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Virión rAAV según la reivindicación 1 o 2 o la célula transducida según la reivindicación 4 o la composición farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 5 como un medicamento.

7. Virión rAAV según la reivindicación 1 o 2 o la célula transducida según la reivindicación 4 o la composición farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 5, para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide.

8. Uso de a) el virión rAAV según la reivindicación 1 o 2 o b) de la célula transducida según la reivindicación 4 o c) de la composición farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 5, para la producción de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide.

9. Uso según la reivindicación 8 a) , donde el medicamento es adecuado para la administración a una célula sinovial in vivo, por administración local del virión rAAV a una articulación reumatoide de un sujeto.

10. Uso según la reivindicación 8 b) o 9, donde el medicamento es adecuado para la inyección en la articulación, preferiblemente por inyección en el compartimiento sinovial.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la célula sinovial transducida produce una reducción de síntomas de artritis de la articulación.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la administración del medicamento se repite después de un cierto periodo de tiempo.