Variantes de la ADN polimerasa y del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y métodos para usarlos.

Una variante del VHB aislada que contiene una mutación en la ADN polimerasa del VHB seleccionada entreS548G y S548C donde dicha variante tiene sensibilidad disminuida a un análogo nucleosídico.

Variantes de la ADN polimerasa y del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y métodos para usarlos Campo de la invención La presente invención se refiere en general a variantes virales que tienen una sensibilidad reducida a los agentes y en particular a los análogos nucleosídicos. Más particularmente, la presente invención apunta a variantes del virus de la hepatitis B que tienen una resistencia parcial o completa a los análogos nucleosídicos. Las variantes también pueden comprender las mutaciones correspondientes que afectan la interactividad inmunológica con los componentes de superficie virales. La presente invención contempla además ensayos para detectar dichas variantes virales los cuales son útiles para controlar regímenes terapéuticos antivirales y para desarrollar vacunas nuevas o modificadas dirigidas contra agentes virales y en particular contra variantes del virus de la hepatitis B. La presente invención también contempla el uso de las variantes virales para detectar selectivamente agentes capaces de inhibir la infección, replicación y/o liberación del virus.

Antecedentes de la invención Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas numéricamente en esta especificación se reúnen al final de la descripción.

Las mutaciones específicas en una secuencia de aminoácidos se representan en este documento como "Xaa1nXaa2" donde Xaa1 es el residuo de aminoácido original antes de la mutación, n es el número del residuo y Xaa2 es el aminoácido mutante. La abreviatura "Xaa" puede ser el código de tres letras o de una sola letra (es decir, "X") . Los residuos de aminoácidos para la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B se numeran adjudicando al residuo de metionina del motivo Tyr Met Asp Asp (YMDD) el número 550.

El virus de la hepatitis B (VHB) puede causar una enfermedad debilitante que puede derivar en insuficiencia hepática aguda. El VHB es un virus de ADN que se replica a través de un intermediario de ARN y utiliza la transcripción inversa en su estrategia de replicación (1) . El genoma del VHB es de naturaleza compleja y tiene una estructura de ADN parcialmente bicatenaria con una superficie que codifica los marcos de lectura abiertos superpuestos, núcleo, polimerasa y genes X. La naturaleza compleja del genoma del VHB se representa en la Figura 1.

La presencia de una ADN polimerasa del VHB condujo a la propuesta de que los análogos nucleosídicos podrían actuar como agentes antivirales eficaces. Los ejemplos de análogos nucleosídicos que se han probado en la actualidad son penciclovir y su forma oral famciclovir [FAM] (2, 3, 4, 5) y lamivudina [LAM] (6, 7) . Adefovir también ha demostrado tener una actividad eficaz anti-VHB in vitro.

La hepatitis, debido a la reactivación del virus de la hepatitis B (VHB) , es una causa principal de morbimortalidad en pacientes positivos para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg+) que son sometidos a trasplante de médula ósea (TMO) (8-10) . La patogenia subyacente está relacionada a la intensa inmunosupresión, durante el tratamiento citotóxico o inmunosupresor, que potencia la replicación viral con el consecuente aumento en la infección de los hepatocitos. La reconstitución subsiguiente con células madre de donantes, junto con la disminución de los inmunosupresores anti-injerto-contra-huésped, restauran la función inmunitaria. Esto resulta en una rápida destrucción de los hepatocitos infectados (11) . El resultado del alotrasplante de médula ósea también es afectado por el estado del VHB del donante (11) . De hecho, se ha demostrado que la depuración serológica de HBsAg en receptores HBsAg+ después del alotrasplante de médula ósea se asoció a injerto de médula positiva al anticuerpo de superficie de la hepatitis B (anti-HBs) y al anticuerpo del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc) (12-17) .

Como se indicó antes, FAM es el profármaco oral de penciclovir [9- (4-hidroxi-3-hidroximetilbut-1-il) guanina; BRL 39123], que se demostró que inhibe la replicación del hepadnavirus tanto en estudios in vitro como in vivo (18-22) . Recientemente, FAM y LAM ( (-) -º-2'-desoxi-3'-tiacitidina o 3TC) se han utilizado con éxito para prevenir/tratar la hepatitis relacionada con la reactivación del VHB al suspender la quimioterapia/inmunosupresión (23, 24) y para prevenir la recidiva del VHB luego del trasplante hepático ortotópico [THO] (25-28) .

Al igual que con LAM, se identificó resistencia a FAM en el escenario post THO tanto en sujetos inmunodeprimidos como inmunocompetentes. Las mutaciones FAM reportadas de la polimerasa asociadas a "recaída" incluyen G518E (29) , V519L (30) , G520C (29) , P523L (30) , L526M (30) , L526V (31) , T530S (29) y V553I (32) . Puesto que el gen de la polimerasa del VHB se superpone al gen de la envoltura, las mutaciones en el dominio catalítico de la polimerasa pueden afectar la secuencia de aminoácidos de la proteína de la envoltura y viceversa. En particular, la secuencia genética para el dominio de neutralización del VHB conocida como el determinante "a", que se encuentra en HBsAg y está ubicada entre los aminoácidos 99 y 169, en realidad se superpone a las regiones catalíticas principales de la proteína polimerasa viral y en particular a los dominios A y B (33) . De hecho, V519L, V553I, G518E se asocian a cambios en el HBsAg de E164D, el codón de parada en 199 y E164K, respectivamente (30, 32, 33) . A la inversa, el uso de IgHB para la profilaxia contra la recidiva del VHB después de un THO se asoció a variantes en el HBsAg, que podrían tener cambios concomitantes en el gen de la polimerasa (34-36) . En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores identificaron la selección de variantes del VHB en receptores positivos para HBsAg tratados con FAM y/o LAM luego del alotrasplante de médula ósea y post-THO. Además de las mutaciones exclusivas en la polimerasa del VHB y el HBsAg seleccionadas durante el tratamiento, hubo una cantidad de cambios en los aminoácidos en algunas cepas del VHB aisladas, que fueron compatibles con un cambio de genotipo del VHB en la población del virus predominante.

De conformidad con la presente invención, los inventores identificaron variantes del VHB, seleccionadas luego del tratamiento con FAM y/o LAM, con mutaciones en el gen de la ADN polimerasa del VHB que reducen la sensibilidad del VHB a este análogo nucleosídico. También se producen mutaciones correspondientes en el antígeno de superficie. La identificación de esas variantes del VHB es importante para el desarrollo de ensayos para controlar la resistencia a FAM y/o LAM y/o la resistencia a otros regímenes terapéuticos con análogos nucleosídicos y para detectar selectivamente agentes que sean útiles como agentes terapéuticos alternativos. Resumen de la invención En toda esta especificación, a menos que el contexto requiera algo diferente, la palabra "comprender" o variaciones como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros declarados, pero no la exclusión de ningún otro elemento ni número entero ni grupo de elementos o números enteros.

Se hace referencia a las secuencias de aminoácidos y nucleótidos mediante un número identificador de la secuencia (SEC, ID Nº:) . Las SEC. ID Nº: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencias <400>1, <400>2, etc. Se proporciona un listado de secuencias después de las reivindicaciones.

Un aspecto de la presente invención apunta a una variante del VHB aislada que contiene una mutación en la ADN polimerasa del VHB seleccionada entre S548G y S548C donde dicha variante tiene una sensibilidad disminuida a un análogo nucleosídico.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una variante del VHB.

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona Otro aspecto de la presente invención contempla un método para determinar la posibilidad de que un VHB presente una sensibilidad reducida a un análogo nucleosídico, donde dicho método comprende aislar el ADN, o el ARNm correspondiente, de dicho VHB y someterlo a una detección selectiva de una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica a la ADN polimerasa del VHB lo que resulta en al menos una sustitución de un aminoácido seleccionado entre S548G y S548C donde la presencia de dicha mutación es una indicación de la probabilidad de resistencia a dicho análogo nucleosídico.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona una composición que contiene una variante del VHB resistente a FAM y/o LAM y opcionalmente... [Seguir leyendo]

1. Una variante del VHB aislada que contiene una mutación en la ADN polimerasa del VHB seleccionada entre 5 S548G y S548C donde dicha variante tiene sensibilidad disminuida a un análogo nucleosídico.

2. Un método para determinar la posibilidad de que un VHB presente una sensibilidad reducida a un análogo nucleosídico, donde dicho método comprende aislar el ADN, o el ARNm correspondiente, de dicho VHB y someterlo a una detección selectiva de una mutación en la secuencia de nucleósidos que codifica la ADN polimerasa del VHB

lo que resulta en al menos una mutación de un aminoácido seleccionado entre S548G y S548C donde la presencia de dicha mutación es una indicación de la probabilidad de resistencia a dicho análogo nucleosídico.