Fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo unsobrenadante en dos partes,

una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el p-nitrofenil fosfato a 37°C y pH 5,5, donde la actividadresidual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la mismamuestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos un 105% de la actividadresidual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende almenos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2; donde al menos una dedichas una a cuatro alteraciones se selecciona de las siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q,273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C,111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.

Variantes de fitasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una fitasa derivada de Citrobacter braakii ATCC 51113 y comprende al menos una alteración respecto a esta fitasa (es decir, es una variante de la misma) . La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, a métodos de su producción, así como al uso de las mismas, por ejemplo, en el

alimento para animales y aditivos de alimento. La parte madura de la fitasa Citrobacter braakii ATCC 51113 está incluida en el listado de secuencias como SEC ID NO:2.

Antecedentes de la invención

Antecedentes de la técnica

La secuencia del gen phyA de Citrobacter freundii ha sido presentada por Zinin et al. a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ con número de acceso AY390262. La secuencia de aminoácidos de fitasa correspondiente se encuentra en las bases de datos UniProt/TrEMBL con número de acceso Q676V7. La parte madura prevista de

Q676V7 se incluye en el presente listado de secuencias como SEC ID NO:4.

La publicación WO-2004/085638 divulga, como SEC ID NO:7, la secuencia de aminoácidos de una fitasa de Citrobacter braakii YH-15, depositada como KCCM 10427. La parte madura de esta secuencia de aminoácidos se incluye en este documento como SEC ID NO: 3. Esta secuencia se encuentra también en la base de datos 25 Geneseqp con número de acceso ADU50737. Esta fitasa (YH-15) fue más tarde clonada en y expresada en Sacchromyces cerevisae mostrando un modelo de glicación modificada y un cambio en la termoestabilidad, cuando se expresa en Sacchromyces cerevisae, Kim et al.: " Molecular cloning of the phytase gene from Citrobacter braakii and its expression in Saccharomyces cerevisiae." Biotechnology Letters 2006, vol. 28, n°. 1. La publicación WO 2006/037328 divulga la fitasa de tipo salvaje de Citrobacter braakii ATCC 51113 (es decir, SEC ID NO:2 en este

documento) , así como una variante de la misma, la cual también se incluye en el presente listado de secuencias, a saber, como SEC ID NO:6.

Las publicaciones WO 2006/038062 y WO 2006/038128 revelan ambas la secuencia de aminoácidos del gen de fitasa de Citrobacter freundii P3-42, depositada con número de acceso NCIMB 41247. Esta secuencia de

aminoácidos se incluye en este documento como SEC ID NO:9.

Es un objetivo de la invención proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente, de propiedades mejoradas. Ejemplos no limitativos de tales propiedades son: termoestabilidad, perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, rendimiento en el alimento para animales, sensibilidad de proteasa, y/o modelo de

glicosilación.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como

45 actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el fosfato de pnitrofenilo a 37°C y pH 5, 5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y

50 dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 de la cual se selecciona al menos uno de los siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.

55 [0007] La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, métodos de su producción, así como el uso del mismo, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de alimento.

Breve descripción de los dibujos

60 [0008]

La Fig. 1 corresponde a la Tabla 2 de la publicación WO 2006/038062 y divulga varias variantes de la fitasa Citrobacter freundii NCIMB 41247 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:9 y la Fig. 2 es una alineación de las fitasas de la SEC ID NO:2 y 9.

65 [0009] Los números de posición en la Fig. 1 se refieren a la numeración de la SEC ID NO:9. Las posiciones de la SEC ID NO:2 correspondientes se pueden encontrar por deducción de 22 (p. ej., la variante P229S de la Fig.1 significa variante P207S usando la numeración de la presente aplicación) .

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina 10 sobre el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5, 5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 de la cual se selecciona al menos uno de los siguientes: 4P, 46E, 107G, 111 P, 119K, 162C,

223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.

El porcentaje de identidad se determina como se describe en la sección "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad".

Los números de posición se refieren a la numeración de posición de la SEC ID NO:2, como se describe en la sección "Numeración de posición." Las posiciones correspondientes a estos números de posición SEC ID NO:2 en otras fitasas se determinan como se describe en la sección "Identificación de los números de posición correspondientes."

La fitasa de la invención es una variante de la fitasa de la SEC ID NO:2, a saber, no es idéntica a la SEC ID NO:2, puesto que comprende al menos una alteración en comparación con la SEC ID NO:2.

En una forma de realización particular, la fitasa de la invención comprende al menos una alteración en

comparación con la SEC ID NO:2 en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.

La nomenclatura usada en este documento para alteraciones se describe en detalle en la sección 35 "Alteraciones, tales como sustituciones, deleciones, inserciones."

La fitasa de la invención puede ser una variante de cualquier tipo salvaje o fitasa variante. En formas de realización particulares, es una variante de la fitasa de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, o una variante de cualquiera de las variantes de fitasa relacionadas con la SEC ID NO:9 y listada en

la Fig.1.

La fitasa de la invención puede además comprender al menos una alteración (sustitución) o una combinación de alteraciones (sustituciones) y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 seleccionadas de entre las alteraciones (sustituciones) y combinaciones de alteraciones (sustituciones) listadas en cada fila de la

45 Fig.1.

La invención también se refiere a una fitasa que tiene al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 y que comprende al menos una de las siguientes alteraciones:

50 (i) 141C/199C, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, y/o 162C/247C;

(ii) 4P, 111 P, 111P/241Q;

(iii) 119K;

(iv) 46E, 276K, 379K, 385D, y 362K, R.

55 Estrategia para preparar variantes

La estructura de la fitasa C. braakii ATCC 51113 fue construida mediante modelado por homología, usando... [Seguir leyendo]

1. Fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el p-nitrofenil fosfato a 37°C y pH 5, 5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos un 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2; donde al menos una de

dichas una a cuatro alteraciones se selecciona de las siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.

2. Fitasa según la reivindicación 1, que comprende una alteración seleccionada de las siguientes: 141C/199C, 15 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 162C/247C, y 111P/241Q.

3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1- 2.

4. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado.

5. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 4. 25

6. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 4 y/o el vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Método para la producción de la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende 30

(a) el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 6 para producir un sobrenadante que comprende la fitasa; y

(b) la recuperación de la fitasa. 35

8. Planta transgénica, o parte de planta, que ha sido transformada con un ácido nucleico según la reivindicación 3 o 4, capaz de expresar una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. Composición que comprende al menos una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y 40

(a) al menos una vitamina soluble en grasa;

(b) al menos una vitamina soluble en agua; y/o

45 (c) al menos un oligoelemento.

10. Composición según la reivindicación 9 comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, y/o beta-glucanasa.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que es un aditivo para alimentación animal.

12. Composición alimentaria para animales con un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende

la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11. 55

13. Método para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales, donde la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 se añade al alimento.

14. Proceso para reducir niveles de fitato en el abono animal que comprende alimentar a un animal con una cantidad 60 eficaz del alimento según la reivindicación 12.

15. Método para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprende el paso de añadir la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 a por lo menos una proteína vegetal o fuente de proteína.

65 16. Uso de la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en alimentos para animales; en la preparación de alimentos para animales; para mejorar el valor nutricional de alimentos para animales; para reducir los niveles de fitato en el abono animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.