Vacunas que comprenden al antígeno MAGE unido a un fragmento de proteína D.

Una composición inmunógena que comprende:

(i) un antígeno MAGE unido a un asociado de fusión heterólogo derivado de la proteína D,

en el que el asociado de fusión comprende aproximadamente el primer 1/3 de la secuencia de la proteína D o aproximadamente los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales de la secuencia de la proteína D;

(ii) una composición coadyuvante que comprende una saponina, junto con un oligonucleótido Inmunoestimulante; y

(iii) un lipopolisacárido elegido del grupo de i monofosforil lípido A ii monofosforil lípido A 3-O-desacilado iii difosforil lípido A.

Vacunas que comprenden el antígeno MAGE unido a un fragmento de proteína D

La presente invención se refiere a una nueva formulación que comprende una combinación de un antígeno tumoral o un derivado del mismo y una composición coadyuvante combinada que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante, una saponina y adicionalmente comprende un lipopolisacárido.

A pesar de las enormes inversiones en recursos humanos y financieros, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer es la causa principal de muerte en mujeres de edades comprendidas entre 35 y 74 años. El cáncer de mama es la neoplasia más habitual en mujeres, y la incidencia de desarrollo del cáncer de mama está aumentando. Se estima que una de cada nueve mujeres será diagnosticada de la enfermedad. Las metodologías estándar para curar el cáncer de mama se han centrado en una combinación de cirugía, radiación y quimioterapia. Estas metodologías han dado como resultado acontecimientos alarmantes en algunas neoplasias. Sin embargo, el cáncer de mama es a menudo incurable, cuando se diagnostica más allá de una cierta etapa. Son necesarias metodologías alternativas de diagnóstico y terapia tempranos.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes que contienen dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") se conocen en este campo por ser coadyuvantes cuando se administran tanto por vía sistémica como mucosa (documento WO 96/02555, documento EP 468520, Davis y col., J. Immunol, 1998, 160 (2) : 870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161 (9) : 4463-6) . CpG es una abreviatura de los motivos dinucleotídicos de citosina-guanosina presentes en el ADN. Históricamente, se observó que la fracción de ADN de BCG podría ejercer un efecto antitumoral. En estudios adicionales, se demostró que oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias génicas de BCG eran capaces de inducir efectos inmunoestimulantes (tanto in vitro como in vivo) . Los autores de estos estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo central CG, portaban esta actividad. El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación fue elucidado posteriormente en una publicación de Krieg, Nature 374, pág. 546, 1995. Un análisis detallado ha demostrado que el motivo CG tiene que estar en un cierto contexto de secuencia, y que dichas secuencias son habituales en el ADN bacteriano, pero son raras en el ADN de vertebrados. La secuencia inmunoestimulante es a menudo: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo dinucleotídico CG no está metilado, pero en la presente invención pueden usarse otras secuencias no CpG metiladas que se sabe que son inmunoestimulantes.

En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos hay presente una secuencia palindrómica. Muchos de estos motivos, bien, repeticiones de un motivo o bien una combinación de diferentes motivos, pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido. La presencia de uno o más de esta secuencia inmunoestimulante que contiene oligonucleótidos puede activar varios subconjuntos inmunes, incluyendo los linfocitos citolíticos naturales (que producen interferón y tienen actividad citolítica) y los macrófagos (Wooldrige y col Vol. 89 (no. 8) , 1977) . Aunque ahora se ha demostrado que otras secuencias que contienen CpG no metilados son inmunomoduladoras.

Cuando se formulan CpG en vacunas, generalmente se administra libre en disolución junto con un antígeno libre (documento WO 96/02555; McCluskie y Davis, supra) o conjugado covalentemente con un antígeno (publicación PCT Nº WO 98/16247) , o formulado con un portador tal como hidróxido de aluminio ( (antígeno de superficie de la hepatitis) Davis y col. supra; Brazolot-Millan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 1998, 95 (26) , 15553-8) .

Las combinaciones coadyuvantes de la presente invención incluyen, en formas de realización preferidas, al menos un coadyuvante derivado del lipopolisacárido enterobacteriano.

Hace mucho que se sabe que el lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) es un potente estimulante del sistema inmune, aunque su uso en coadyuvantes se ha restringido debido sus efectos tóxicos. Un derivado no tóxico del LPS, el monofosforil lípido A (MPL) , producido mediante la eliminación del grupo de carbohidrato central y el fosfato del extremo reductor de glucosamina, ha sido descrito por Ribi y col (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, págs. 407-419) y tiene la siguiente estructura:

Una versión desintoxicada adicional del MPL resulta de la eliminación de la cadena de acilo de la posición 3 del esqueleto del disacárido, y se denomina monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) . Puede purificarse y prepararse mediante los procedimientos enseñados en el documento GB 2122204B, cuya referencia también desvela la preparación del difosforil lípido A, y de variantes 3-O-desaciladas del mismo. Una forma preferida del 3D-MPL estará en la forma de una emulsión con un tamaño de partícula pequeño, inferior a 0, 2 μm de diámetro, y su procedimiento de elaboración se desvela en el documento WO 94/21292. Las formulaciones acuosas que comprenden monofosforil lípido A y un tensioactivo se han descrito en el documento WO 98/43670A2.

Los coadyuvantes derivados del lipopolisacárido bacteriano que se van a formular en las combinaciones coadyuvantes de la presente invención pueden purificarse y procesarse a partir de fuentes bacterianas, o alternativamente pueden ser sintéticos. Por ejemplo, se describe el monofosforil lípido A purificado en Ribi y col.1986 (supra) , y el monofosforil o el difosforil lípido A 3-O-desacilado derivado de especies de Salmonella se describen en el documento GB 2220211 y en el documento US 4912094. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos (documento WO 98/01139; documento US 6.005.099 y documento EP 0 729 473 B1; Hilgers y col., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79 (4) : 392-6; Hilgers y col., 1987, Immunology, 60 (1) : 141-6; y documento EP 0 549 074 B1) . Un coadyuvante de lipopolisacárido bacteriano preferido es 3D-MPL.

Las combinaciones de coadyuvantes de 3D-MPL y saponina derivados de la corteza de Quillaja Saponaria molina se han descrito en el documento EP 0 761 231B. El documento WO 95/17210 desvela un sistema en emulsión coadyuvante basado en escualeno, a-tocoferol, y polioxietilenmonooleato de sorbitano (TWEEN 80) , formulado con el inmunoestimulante QS21, opcionalmente con 3DMPL.

Las saponinas se conocen como coadyuvantes en vacunas para su administración sistémica. La actividad coadyuvante y hemolítica de las saponinas individuales se ha estudiado ampliamente en la técnica (Lacaille-Dubois y Wagner, supra) . Por ejemplo, el Quil A (derivado de la corteza del árbol suramericano Quillaja Saponaria Molina) , y fracciones del mismo, se describen en el documento US 5.057.540 y en "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2) : 1-55; y en el documento EP 0 362 279 B 1.

Las estructuras particuladas, denominadas complejos inmunoestimulantes (Immune Stimulating Complexes, ISCOMS) , que comprenden fracciones de Quil A, son hemolíticas y se han usado en la elaboración de vacunas (Morein, B., documento EP 0 109 942 B1) . Se ha informado de que estas estructuras tienen actividad coadyuvante (documento EP 0 109 942 B1; documento WO 96/11711) .

Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por HPLC de Quil A) se han descrito como potentes coadyuvantes sistémicos, y el procedimiento de su producción se desvela en la patente de EE.UU. Nº 5.057.540 y en el documento EP 0 362 279 B1. En estas referencias también se describe el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil-A) , que actúa como un potente coadyuvante para vacunas sistémicas. El uso de QS21 se describe adicionalmente en Kensil y col. (1991. J. Immunology, vol. 146, 431-437) . También se conocen las combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina (documento WO 99/10008) . Los sistemas coadyuvantes particulados que comprenden fracciones de QuilA, tales como QS21 y QS7, se describen en el documento WO 96/33739 y en el documento WO 96/11711.

Otras saponinas que se han usado en los estudios de vacunación sistémica incluyen las derivadas de otras especies vegetales tales como Gypsophila y Saponaria (Bomford y col., Vaccine, 10 (9) : 572-577, 1992) .

También se sabe que las saponinas se han usado en estudios de vacunas aplicadas en mucosas, que han cumplido con un éxito variable la inducción de respuestas... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunógena que comprende

(i) un antígeno MAGE unido a un asociado de fusión heterólogo derivado de la proteína D, en el que el asociado de fusión comprende aproximadamente el primer 1/3 de la secuencia de la proteína D o aproximadamente los primero.

10. 110 aminoácidos N-terminales de la secuencia de la proteína D;

(ii) una composición coadyuvante que comprende una saponina, junto con un oligonucleótido Inmunoestimulante; y

(iii) un lipopolisacárido elegido del grupo de i monofosforil lípido A ii monofosforil lípido A 3-O-desacilado iii difosforil lípido A.

2. Una composición según se reivindica en la reivindicación 1 en la que la saponina es QS21.

3. Una composición inmunógena según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en la que el oligonucleótido Inmunoestimulante contiene al menos dos motivos CpG.

4. Una composición inmunógena según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el oligonucleótido Inmunoestimulante se elige del grupo:

ID. de secuencia Nº 1 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) ID. de secuencia NÂ.

2. TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) ID. de secuencia NÂ.

3. ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG ID. de secuencia NÂ.

4. TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) ID. de secuencia NÂ.

5. TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

5. Una composición según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que la saponina se formula para formar ISCOMS o liposomas.

6. Una composición según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la que la saponina está presente en una emulsión de aceite en agua.

7. Uso de una combinación de una saponina, un oligonucleótido Inmunoestimulante, un lipopolisacárido elegido del grupo de (i) monofosforil lípido A; (ii) monofosforil lípido A 3-O-desacilado; y (iii) difosforil lípido A y un antígeno MAGE unido a un asociado de fusión heterólogo derivado de la proteína D, en el que el asociado de fusión comprende aproximadamente el primer 1/3 de la secuencia de la proteína D o aproximadamente los primeros 100110 aminoácidos N-terminales de la secuencia de la proteína D, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de tumores.

Punto medio FIGUR.

14. Distribución de isotipos anti-NS1-P703P inducidos mediante vacunas