Un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C que comprende la secuencia TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO. 13) .

Uso de oligonucleótidos CPG en el tratamiento de infección por el virus de la hepatitis C

Campo de la Invención La invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimulantes CpG clase C que comprenden la secuencia TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO. 13) , que pueden utilizarse para el tratamiento de individuos infectados crónicamente con el virus de la hepatitis C.

Antecedentes de la Invención El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus de RNA de cadena positiva de la familia Flavivirus que infecta los hepatocitos de humanos y algunos otros primates. Caracterizado por primera vez en 1989 (1) , HCV tiene un genoma de 9, 5 kb que codifica tres proteínas estructurales: la proteína del núcleo y dos glicoproteínas de la envoltura (E1 y E2) , así como varias proteínas no estructurales (NS) que están implicadas en la replicación viral y la interacción con la célula hospedadora (2) .

HCV es un problema grave de salud pública, causando > 90% de la hepatitis parenteral no-A, no-B (1) . De 0, 4 a 1, 5% de la población mundial está infectada (3, 4) , incluyendo aproximadamente 300.000 canadienses (Health Canada) . Es difícil recopilar estadísticas epidemiológicas dado que la gran mayoría de las infecciones agudas son subclínicas; sin embargo, se estima que 50-80% de los individuos infectados con HCV no consiguen eliminar el virus, y la mayoría de éstos se convierten en portadores durante toda su vida. Aproximadamente 50% de los portadores desarrollan hepatitis crónica y 20% de éstos desarrollarán cirrosis hepática, muchos de los cuales desarrollarán posteriormente carcinoma hepatocelular (5-9) . La hepatitis C causa un número estimado de 8.000 a

10.000 fallecimientos anualmente en los Estados Unidos (CDC) .

En los Estados Unidos y Canadá existen dos regímenes diferentes, que han sido aprobados como terapia para la hepatitis C: monoterapia con interferón alfa y terapia de combinación con interferón alfa y Ribavirina. Aunque más costosa y asociada con más efectos secundarios, la terapia de combinación proporciona consistentemente mayores tasas de respuesta sostenida que la monoterapia.

Están disponibles varias formas de interferón alfa (alfa-2a, alfa-2b, e interferón de consenso (Alfacon) ) . Estos interferones se administran típicamente por vía subcutánea tres veces por semana. El interferón pegilado, es decir, interferón alfa modificado por adición de polietilenglicol (PEG) a fin de aumentar la duración en la circulación, es distinto de interferón y se administra una sola vez por semana. La Ribavirina, por el contrario, es un agente anti-viral oral que se administra dos veces al día en cápsulas de 200 mg.

Los efectos secundarios de interferón alfa incluyen: fatiga, dolores musculares, dolores de cabeza, náuseas y vómitos, irritación de la piel en el sitio de inyección, fiebre de nivel bajo, pérdida de peso, irritabilidad, depresión, suicidio, supresión moderada de la médula ósea y pérdida del cabello (reversible) . En el caso de la Ribavirina los efectos secundarios incluyen: fatiga por anemia e irritabilidad, picor, erupción cutánea, mala ventilación nasal, sinusitis y tos.

El tratamiento con interferón solo o en combinación con interferón y Ribavirina conduce a mejoras rápidas en los niveles de ALT en suero en el 50-75% de los pacientes y la desaparición de RNA de HCV detectable del suero en el 30-50% de los pacientes. La mejora de larga duración en la enfermedad hepática ocurre usualmente sólo si desaparece el RNA de HCV durante la terapia y se mantiene indetectable durante al menos 6 meses después de completarse la terapia. El tratamiento de combinación da como resultado a la vez una mayor tasa de pérdida de RNA de HCV durante el tratamiento y una tasa menor de recidiva cuando se completa el tratamiento. Sin embargo, los resultados dependen acusadamente del genotipo del virus, obteniéndose los mejores resultados para los genotipos 2 y 3 (aproximadamente 90% con 1 año de tratamiento con IFN-a pegilado y Ribavirina) , pero resultados mucho más pobres (aproximadamente 40% de respuesta sostenida) para HCV del genotipo 1. La mayoría de los portadores crónicos de HCV en Norteamérica son actualmente de genotipo 1.

La duración óptima del tratamiento varía dependiendo de si se utiliza monoterapia con interferón o terapia de combinación, así como del genotipo del HCV. Típicamente, la duración está comprendida entre 6 y 12 meses.

Actualmente no existe ninguna vacuna contra HCV, o terapia de alta eficacia para la infección crónica. Así pues, existe una necesidad urgente de un tratamiento eficaz que pudiera utilizarse para tratar los portadores crónicos.

Sumario de la Invención La invención está basada en parte en varios descubrimientos sorprendentes que incluyen la observación de que pueden utilizarse ácidos nucleicos inmunoestimulantes CpG para tratar individuos que están infectados crónicamente con el virus de la hepatitis C (HCV) y que son no-respondedores a las terapias no-CpG administradas previamente. La invención está basada adicionalmente en parte en la observación de que puede lograrse una respuesta sinérgica en tales individuos por el uso combinado de ácidos nucleicos inmunoestimulantes CpG y un agente anti-viral tal como IFN-alfa.

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C que comprende la secuencia TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO. 13) .

En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C comprende la secuencia TCGTCGTTTTAC-GGC-GCC-GTGCCG (SEQ ID NO. 13) , TCGTCG-TTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID NO. 14) o TCGTC-GTTT-TAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID NO. 15) , en donde los eslabones inter-nucleotídicos representados como "-" son fosfodiéster y el resto son fosforotioato, o tiene una secuencia de bases constituida por TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO. 13) .

En otro aspecto, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes CpG clase C del primer aspecto son para uso en el tratamiento de la infección HCV crónica en un individuo.

En otro aspecto, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes CpG clase C del primer aspecto son para uso en un tratamiento de un individuo que padece una infección crónica de HCV que ha sido tratado sin éxito utilizando una terapia no-CpG previa que incluye interferón-a, comprendiendo dicho tratamiento administrar una cantidad eficaz de dicho ácido nucleico inmunoestimulante CpG a dicho individuo para tratar la infección.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la inducción de la secreción de IFN-a por PBMCs infectados con HCV y normales después de estimulación con tres clases de CpG. PBMCs de individuos normales o infectados con HCV se incubaron con diferentes clases de CpG durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de células y se ensayaron respecto a secreción de IFN-a por kits ELISA comerciales. La secreci-a para 10 individuos normales y 10

ón media de IFN individuos infectados con HCV se representa por las barras negras.

La Figura 2 muestra el análisis citométrico de flujo de PBMCs recién aislados de portadores crónicos de HCV e individuos normales. Se aislaron PBMCs de la sangre de individuos infectados con HCV y de donantes sanos normales y se sometieron a inmunotinción con anticuerpos anti-células dendríticas plasmacitoides (pDC) marcados fluorescentemente. Las células se analizaron en un citómetro de flujo y los resultados se compararon con datos de secreción de IFN-a en estos nuevos individuos cuando se estimularon con CpG.

La Figura 3 muestra la inducción de INF-a por estimulaciy

ón de PBMCs con oligonucleótidos clase C oligonucleótidos C flexibles. PBMCs de individuos normales o infectados con HCV se incubaron con diferentes clases de CpG durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de células y se ensayaron respecto a secreción de IFN-a por kits ELISA comerciales. La secreci-a para 10 individuos normales y 10 individuos ón media de IFN infectados con HCV se representa por las barras negras.

La Figura 4 muestra la inducción de IFN-a después de estimulación con un panel de CpG clase C semiflex ible. PBMCs aislados de 5 individuos infectados con HCV se incubaron con un panel de oligonucleótidos clase C semiflexibles durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de células y se ensayaron respecto a secreción de IFN-a por kits ELISA comerciales. La secreción media de IFN-a para 5 individuos infectados con HCV se representa por las barras negras.

La Figura... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C que comprende la secuencia TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO. 13) .

2. Un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la 5 secuencia:

(a) TCGTCGTTTTAC-GGC-GCC-GTGCCG (SEQ ID NO: 13) ;

(b) TCGTCG-TTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID NO: 14) ; o

(c) TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID NO: 15) ; en donde los enlaces inter-nucleotídicos representados como "-" son fosfodiéster y los restantes son fosforotioato.

3. Un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, con una secuencia de bases constituida por TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO: 13) .

4. Un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para uso en el tratamiento de una infección de HCV crónica en un individuo.

5. Un ácido nucleico inmunoestimulante CpG clase C de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para

uso en el tratamiento de un individuo que padece una infección de HCV crónica que ha sido tratado sin éxito utilizando una terapia previa sin CpG que incluye interferón-alfa, comprendiendo dicho tratamiento administrar una cantidad eficaz de dicho ácido nucleico inmunoestimulante CpG a dicho individuo para tratar la infección.