REDUCCIÓN ENZIMÁTICA PARA PRODUCIR ALCOHOLES ÓPTICAMENTE ACTIVOS.

Método para la preparación de alcanoles ópticamente activos de la fórmula I donde n representa un valor de número entero desde 0 a 5;

Cyc representa un anillo carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, mono- o polinuclear, opcionalmente sustituido, y R 1 representa halógeno, SH, OH, NO2, NR 2 R 3 o NR 2 R 3 R 4+ X - , donde R 2 , R 3 y R 4 , independientemente unos de otros, representan H o un residuo alquilo inferior de C1-C8 o alcoxi inferior de C1-C8 y X - representa un contra-ión, en cuyo caso en un medio que contiene una alcanona de la fórmula II en la que n, Cyc y R 1 poseen los significados indicados arriba, se incuba una enzima con una secuencia de polipéptido (i) SEQ ID NO: 1 o (ii) (ii) en la que hasta el 25% de los residuos de aminoácidos se han modificado frente a la secuencia SEQ ID NO:1 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de éstas y posee aún al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO:1, en cuyo caso el compuesto de la fórmula II se reduce de manera enzimática hasta el compuesto de la fórmula I y se aísla el producto formado

La presente invención se refiere a un método para producir alcanoles ópticamente activos mediante reducción 5 enzimática de las cetonas correspondientes, en especial para la producción de (1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan

1-ol y (1S)-3-cloro-1-(2-tienil)-propan-1-ol.

Estado de la técnica:

(1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol ("alcohol de duloxetina") es un bloque de construcción en la síntesis de duloxetina. La Duloxetina® es un principio activo farmacéutico que en la actualidad se encuentra en la etapa de aprobación y está indicado para emplearse en la depresión y la incontinencia.

EP-B-0273658 describe un método para producir la base correspondiente de duloxetina mediante reacción de 2acetiltiofeno en una reacción de Mannich con formaldehído y dimetilamina, reducción del grupo ceto de la base de Mannich obtenida en este caso para producir (S)-3-N,N-dimetilamino-1-(tien-2-il)propan-1-ol racémico, eterificación de la función alcohol con fluoruro de naftilo y finalmente conversión del grupo dimetilamino en una función metilamino. El enantiómero deseado del éter naftilo se obtiene mediante el empleo de materias primas quirales o mediante separación de racematos en la etapa del producto final, por ejemplo mediante sales con ácidos ópticamente activos o por cromatografía en una fase estacionaria.

US-5,362,886 describe un método análogo en el que se mezcla el propanol racémico, obtenido después de la reducción del grupo ceto, con ácido S-mandélico. El S-enantiómero del alcohol se emplea en las etapas siguientes 20 de la reacción. EP-A-0457559 describe también un proceso análogo al de la EP-B-0273658. Aquí, el grupo ceto de la base de Mannich se reduce con el sistema de reducción asimétrico LAH-lcb (hidruro de litio aluminio -[(2R,2S)-(-)4-dimetilamino-1,2-difenil-3-metil-2-butanol]) para producir alcohol en forma del S-enantiómero. La desventaja aquí, además de los costes, es la sensibilidad del sistema de reducción LAH-lcb que es estable solo unos pocos minutos.

W. J. Wheeler y F. Kuo describen en el Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, volume XXXVI, No. 3, páginas 213 a 223, un método para la producción de duloxetina. Para este propósito se hace reaccionar cloruro de ácido tiofen-2-carboxílico en un acoplamiento de Stille con estanato de vinil-tri-n-butilo en presencia de cantidades catalíticas de bencilcloro-bis(trifenilfosfina) paladio (II) en DMPU (dimetilpropilenurea) para producir 1(tien-2-il)-propenona de la fórmula (V),

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30 la cual se convierte a continuación mediante tratamiento con cloruro de hidrógeno en 3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1ºna de la fórmula (VI)

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La cloropropanona así obtenida se reduce a continuación usando una oxazaborilidina quiral y BH3 para producir (S)3-cloro-1-(tien-2-il)-propan-1-ol de la fórmula (VII)

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El alcohol obtenido de esta manera se convierte mediante reacción sucesiva con yoduro de sodio y se convierte a continuación con metilamina en (S)-3-metilamino-1-(tien-2-il)-propan-1-ol. Mediante reacción siguiente sucesiva con hidruro de sodio, 1-fluoronaftalina y cloruro de hidrógeno se obtiene en forma del cloruro de hidrógeno

**(Ver fórmula)**

Hal = Halógeno WO 05/108590 describe dehidrogenasas para la producción de alcanoles ópticamente activos mediante reducción de las alcanonas correspondientes, en especial para la producción de 3-metilamino-1-(2-tienil)-propanona y 3-cloro1-(2-tienil)-propanona. WO 05/033094 describe métodos enzimáticos y no enzimáticos para la producción de 3-metilamino1-(tien-2-il)-propan-1-ol así como enzimas para la realización de estos métodos. Descripción breve de la invención: El objetivo en el que se fundamentó la invención fue encontrar un camino para la reducción estereoespecífico de

alcanonas sustituidas, como la 3-metilamino-1-(2-tienil)-propanona y la 3-cloro-1-(2-tienil)-propanona. 15 Este objetivo se logra por el hallazgo sorprendente de las enzimas con actividad de dehidrogenasa que pueden

producirse a partir de microorganismos del género Lactobacillus, en especial de la especie Lactobacillus brevis, que son capaces de la catálisis estereoespecífica de la reacción de arriba. Un primer objeto de la invención se refiere a un método para producir alcanoles ópticamente activos de la fórmula I

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20 donde

n representa un valor de número entero de 0 a 5;

Cyc representa un anillo carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, opcionalmente sustituido, de uno o más

núcleo, y

R1 representa halógeno, SH, OH, NO2, NR2R3 o NR2R3R4+X-, en cuyo caso R2, R3 y R4, independientemente uno de 25 otro, representan H o un residuo alquilo inferior de C1-C6 o alcoxi inferior de C1-C6 y X -representa un contraión, en

cuyo caso, en un medio que contiene alcanona de la fórmula II donde n, Cyc y R1 tienen los significados arriba indicados, se incuba una enzima con una secuencia de polipéptido

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(i) SEQ ID NO: 1 o

(ii) en la cual, en comparación con la SEQ ID NO: 1 se han modificado hasta un 25% de los residuos de aminoácidos mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de éstas y posee además por lo menos un 50% de la actividad enzimática de SEQ ID NO:1,

En cuyo caso el compuesto de la fórmula II se reduce enzimáticamente hasta el compuesto de la fórmula I, y se aisla el producto formado. En una forma particularmente preferida de realización, el método sirve para la preparación de derivados del 1-(2-tienil)-(S)-propanol de la fórmula III

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donde R1 = Cl o NHCH3, donde en un medio que contiene un derivado de la 1-(2-tienil)-propanona de la fórmula IV,

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este compuesto se reduce enzimáticamente hasta el compuesto de la fórmula III, y el producto formado se aísla 15 esencialmente en forma enantioméricamente pura.

En este método se usa preferentemente una enzima con actividad de dehidrogenasa, la cual puede prepararse a partir de microorganismos de los géneros Lactobacillus.

De manera particularmente preferida se usan dehidrogenasas de Lactobacillus brevis.

En una forma particularmente preferida de realización del método, la enzima con actividad de dehidrogenasa se selecciona entre enzimas que comprenden una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 o una secuencia derivada de la misma, en la cual hasta un 25%, preferible hasta un 20%, particularmente preferible hasta un 15%, en especial hasta un 10, un 9, un 8, un 7, un 6, un 5, un 4, un 3, un 2, un 1 % de los residuos de aminoácidos se han modificado mediante una deleción, una sustitución, una inserción o una combinación de deleción, sustitución e inserción, en cuyo caso las secuencias de polipéptidos modificadas frente a la SEQ ID NO: 1 además poseen al menos un 50%, preferible un 65%, particularmente preferible un 80%, en especial más de 90 % de la actividad enzimática de la SEQ ID NO:1. En este contexto debe entenderse como actividad enzimática de SEQ ID NO:1 a la capacidad de reducir las cetonas de la fórmula (IV) con R1 = Cl de manera enantioselectiva hasta el (S)-alcohol con la fórmula general (III).

De manera preferente, el método de la invención se realiza adicionando equivalentes de reducción (NADH o NADPH) o en las condiciones (bioquímicas o electroquímicas) que regeneran los equivalentes de reducción consumidos en la reacción. Para estas formas preferidas de realización se hace referencia a los ejemplos 5 y 6 que describen los sistemas de regeneración aplicables de manera general.

Otra forma adecuada de realización para una regeneración de co-factor en el método de la invención es el uso de un compuesto oxidable, inmiscible con agua, por ejemplo un alcohol superior, preferible hexanol, el cual puede presentarse en una segunda fase líquida en el medio de reacción.

Además, se prefiere hacer reaccionar el compuesto de la fórmula general II, como por ejemplo de la fórmula IV, en presencia de un microorganismo que se selecciona entre bacterias de las familias enterobacteriaceae, pseudomonadaceae, rhizobiaceae, streptomycetaceae y nocardiaceae. El microorganismo puede ser especialmente un microorganismo recombinante que se transforma con un constructo de ácido nucleico, el cual codifica para... [Seguir leyendo]

1. Método para la preparación de alcanoles ópticamente activos de la fórmula I

**(Ver fórmula)**

donde 5 n representa un valor de número entero desde 0 a 5;

Cyc representa un anillo carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, mono-o polinuclear, opcionalmente sustituido, y R1 representa halógeno, SH, OH, NO2, NR2R3 o NR2R3R4+X-, donde R2, R3 y R4, independientemente unos de otros,

representan H o un residuo alquilo inferior de C1-C8 o alcoxi inferior de C1-C8 y X -representa un contra-ión, 10 en cuyo caso en un medio que contiene una alcanona de la fórmula II

**(Ver fórmula)**

en la que n, Cyc y R1 poseen los significados indicados arriba, se incuba una enzima con una secuencia de polipéptido

(i) SEQIDNO:1º

15 (ii) (ii) en la que hasta el 25% de los residuos de aminoácidos se han modificado frente a la secuencia SEQ ID NO:1 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de éstas y posee aún al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO:1,

en cuyo caso el compuesto de la fórmula II se reduce de manera enzimática hasta el compuesto de la fórmula I y se aísla el producto formado.

20 2. Método según la reivindicación 1, para la preparación de derivados del 1-(2-tienil)-(S)-propanol de la fórmula III

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donde R1 = Cl o NHCH3, en cuyo caso en un medio que contiene derivados de la 1-(2-tienil)-propanona de la fórmula IV

**(Ver fórmula)**

se reduce enzimáticamente este compuesto hasta el compuesto de la fórmula III, y se aísla el producto enantioméricamente puro con al menos 90%ee.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la enzima se selecciona entre enzimas de microorganismos del género de Lactobacillus.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la conversión se realiza adicionando equivalentes de reducción o en condiciones que regeneran los equivalentes de reducción consumidos durante la conversión.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque se realiza una regeneración de los cofactores con un alcanol de C2-C10.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la conversión del compuesto de la fórmula II se

10 efectúa en presencia de un microorganismo que se selecciona entre bacterias de las familias de Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae y Nocardiaceae.

7. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde el microorganismo es un microorganismo recombinante que se transforma con un constructo de ácido nucleico, el cual codifica para una enzima según la definición en la reivindicación 1.

15 8. Enzima que tiene actividad de dehidrogenasa con un secuencia de polipéptido

(i) SEQ ID NO: 1 o

(ii) en la que hasta el 25% de los residuos de aminoácidos se ha modificado frente a SEQ ID NO:1 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de éstas y que posee aún al menos el 50% de la actividad enzimática de SEQ ID NO:1.

20 9. Uso de una enzima que tiene actividad dehidrogenasa con una secuencia de polipéptido

(i) SEQ ID NO: 1 o

(ii) en la que hasta el 25% de los residuos de aminoácidos se ha modificado frente a la SEQ ID NO:1 mediante deleción, inserción, sustitución o una combinación de las mismas y que posee aún al menos el 50% de la actividad enzimática de SEQ ID NO:1 para la preparación de compuestos de las fórmulas I o III.

25 10. Uso según la reivindicación 9 en un método para la preparación de duloxetina.