BIOSINTESIS DE SUSTRATOS DE POLICETIDO SINTASA.

Célula huésped de E. coli recombinante que esta modificada genéticamente para la síntesis de 2S-metilmalonil CoA y un policétido,

en la que dicha modificación comprende la incorporación de un sistema de expresión de propionil CoA carboxilasa (pcc); y la incorporación de al menos un sistema de expresión para la policétido sintasa modular (PKS)

Biosíntesis de sustratos de policétido sintasa.

Declaración de derechos en relación a invenciones realizadas bajo investigación patrocinada por el gobierno federal

La presente invención fue realizada con la ayuda del gobierno de U.S. del National Institutes of Health y la National Science Foundation. El gobierno de U.S. puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

Campo técnico

La invención se refiere a procedimientos de adaptación de huéspedes procarióticos para la producción eficiente de policétidos. En un aspecto, los huéspedes son modificados para sintetizar las unidades iniciadoras y/o extensoras usadas por las policétido sintasas en la síntesis de policétidos. Pueden realizarse también otras modificaciones a los huéspedes. De esta manera, la invención incluye procedimientos para la producción de policétidos complejos en organismos tan diversos como Escherichia coli, Bacillus, Myxococcus y Streptomyces.

Técnica anterior

Los policétidos complejos, tales como 6-desoxieritronolida B (6-dEB), el núcleo macrocíclico de la eritromicina antibiótica, constituyen una clase importante de productos naturales. Estos son sintetizados mediante policétido sintasas "modulares", que se encuentran generalmente en actinomycetes. Por ejemplo, la policétido sintasa (PKS) que resulta en la síntesis de 6-dEB es producida en Sacromyces erythraea. Los policétidos producidos en estos huéspedes nativos son generalmente modificados subsiguientemente para obtener el antibiótico terminado mediante glicosilación, oxidación, hidroxilación y otras reacciones modificadoras. Trabajos recientes de este laboratorio han demostrado que es posible expresar módulos policétido sintasa en una forma funcional en Escherichia coli (Gokhale, R.S., et al., Science (1999) 284:482-485). Sin embargo, con el objetivo de aprovechar estas enzimas modulares para la biosíntesis de policétidos en E. coli, o en otros huéspedes que no los producen normalmente, también es necesario producir sus sustratos apropiados in vivo en una manera controlada. Por ejemplo, metabolitos, tales como acetil-CoA, propionil-CoA, malonil-CoA y metilmalonil-CoA son los sustratos más comunes de estas enzimas. E. coli tiene la capacidad para producir acetil-CoA, propionil-CoA y malonil-CoA; sin embargo, estos dos últimos sustratos están presentes solo en pequeñas cantidades en la célula, y su biosíntesis está estrictamente controlada. La capacidad de E. coli para sintetizar metilmalonil-CoA no se ha documentado hasta la fecha.

Prevalecen condiciones similares en otras células microbianas, especialmente las que no producen policétidos de manera nativa, tales como varias especies de Escherichia, Bacillus, Pseudomonas y Flavobacterium. De esta manera, en general, es posible que las unidades iniciadoras y/o extensoras requeridas no se produzcan en las cantidades adecuadas en un huésped particular. Además, mediante una selección apropiada de los dominios de acil transferasa (AT) de la PKS en cuestión, pueden emplearse sustratos más complejos que los indicados anteriormente. Como ejemplo, la PKS para la síntesis de FK506 comprende un dominio de acil transferasa que incorpora sustratos tales como propil malonil-CoA con preferencia sobre malonil-CoA o metilmalonil-CoA. Sería útil disponer de un procedimiento que proporcione este intervalo de sustratos en niveles apropiados en cualquier organismo huésped elegido arbitrariamente.

Problemas adicionales que puede ser necesario superar al realizar la producción de policétidos en huéspedes procarióticos, especialmente los que no producen policétidos de manera nativa, incluyen la presencia de enzimas que catabolizan las unidades iniciadoras y/o extensoras requeridas, tales como enzimas codificadas por el operón prp de E. coli, que son responsables del catabolismo del propionato exógeno, como una fuente de energía y carbono en este organismo. Con el fin de optimizar la producción de un policétido que utiliza propionil CoA como unidad iniciadora y/o utiliza su producto de carboxilación, metilmalonil CoA, como una unidad extensora, este operón debería ser inutilizado, excepto por esa porción (el sitio E) que codifica un propionil CoA sintetasa. Cualquier sitio adicional que codifica enzimas catabolizantes para unidades iniciadoras o extensoras es inutilizado también ventajosamente.

Además, un huésped procariótico particular, tal como E. coli, puede carecer de la fosfopanteteinil transferasa requerida para la activación de la policétido sintasa. Puede requerirse la modificación del huésped para contener también dicha transferasa.

El documento WO98/27203 describe un sistema vector múltiple, en el que se prevén sistemas de expresión para los propios genes policétido sintasa y opcionalmente cofactores para activar las proteínas codificadas. El documento WO95/08548 describe la preparación de plásmidos que contienen genes que codifican proteínas policétido sintasa y su transfección en células huésped. También describe células huésped en las que sus propias células policétidas han sido eliminadas.

Stassi, PNAS (1998) 95 describe el reemplazo de un dominio acil transferasa (AT) de una policétido sintasa de eritromicina con un dominio AT etil malonato específico de la policétido sintasa de nidamicina. Tang J. Bacteriology (1994) describe manipulaciones relacionadas con las unidades iniciadoras y/o extensoras. El artículo describe la inhabilitación de una ruta para la síntesis de las unidades iniciadoras/extensoras en vez de para su catabolismo. Kao, Science (1994) 265, describe plásmidos que contienen la policétido sintasa para GdEB y células eliminadas para genes PKS.

En resumen, sería ventajoso realizar la producción de policétidos en huéspedes microbianos, especialmente huéspedes procariotas en general, y particularmente, en huéspedes que no producen policétidos de manera nativa. Frecuentemente, estos huéspedes tienen ventajas sobre los productores nativos de policétidos, tales como Streptomyces, en términos de facilidad de transformación, capacidad para crecer rápidamente en cultivo y similares. Estas ventajas son particularmente útiles en la valoración de los resultados de mutagénesis aleatoria o transposiciones genéticas de policétido sintasas. De esta manera, la invención proporciona una multiplicidad de enfoques para adaptar huéspedes microbianos para la producción de policétidos.

Divulgación de la invención

La invención ha conseguido, por primera vez, la producción de un producto policétido completo, 6-dEB, en el organismo huésped E. coli, universalmente útil. Los procedimientos usados para conseguir este resultado son adaptables a huéspedes microbianos en general, especialmente procarióticos. Pueden usarse para adaptar huéspedes microbianos, que no producen policétidos de manera nativa, a dicha producción y para mejorar la producción de policétidos en huéspedes que los producen normalmente. Dependiendo del huésped elegido, las modificaciones requeridas pueden incluir la incorporación en el organismo de sistemas de expresión para los propios genes policétido sintasa; inhabilitación de los genes endógenos que codifican para enzimas catabólicas para las unidades iniciadoras y/o extensoras; incorporación de sistemas de expresión para enzimas requeridas para la modificación post-translacional de las sintasas, tales como fosfopanteteinil transferasa; e incorporación de enzimas que mejoran los niveles de las unidades iniciadoras y/o extensoras. La combinación particular de modificaciones requeridas para adaptar el huésped variará dependiendo de la naturaleza del policétido deseado y de la naturaleza del propio huésped.

La presente invención proporciona un célula huésped E. coli recombinante que es modificada genéticamente para la síntesis de 2S-metilmalonil CoA y un policétido, en la que dicha modificación comprende la incorporación de un sistema de expresión de propionil CoA carboxilasa (pcc); y la incorporación de al menos un sistema de expresión para la policétido sintasa (PKS) modular.

En la presente memoria se describen células microbianas que son modificadas genéticamente para la síntesis mejorada de al menos un policétido, en las que dicha modificación comprende la incorporación de al menos un sistema de expresión para producir una proteína que cataliza la producción de unidades iniciadoras y/o extensoras y/o para inhabilitar al menos una ruta endógena para el catabolismo de las unidades...

1. Célula huésped de E. coli recombinante que esta modificada genéticamente para la síntesis de 2S-metilmalonil CoA y un policétido, en la que dicha modificación comprende la incorporación de un sistema de expresión de propionil CoA carboxilasa (pcc); y la incorporación de al menos un sistema de expresión para la policétido sintasa modular (PKS).

2. Célula huésped según la reivindicación 1, en la que el sistema de expresión de pcc comprende los genes pccB y accA2 de S. coelicolor.

3. Célula huésped según la reivindicación 1 ó 2, en la que la modificación comprende además la incorporación de al menos un sistema de expresión para fosfopanteteinil transferasa.

4. Célula huésped según la reivindicación 3, en la que el sistema de expresión de fosfopanteinil transferasa comprende el gen sfp de Bacillus subtilis.

5. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la célula huésped comprende además un sistema de expresión para biotina ligasa.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, en la que el sistema de expresión para biotina ligasa es el gen birA de E. coli.

7. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el operón prpA-D de la célula esta eliminado.

8. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la PKS es desoxieritronolida B sintasa (DEBS).

9. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el policétido es 6-desoxieritronolida B (6-dEB).

10. Procedimiento de producción de policétidos, cuyo procedimiento comprende el cultivo de células según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 bajo condiciones en las que dicho policétido es producido.

11. Procedimiento para valorar los resultados de un procedimiento que realiza una modificación de los genes policétido sintasa, resultando en una mezcla de dichos genes modificados, cuyo procedimiento comprende transfectar un cultivo de E. coli según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con dicha mezcla de genes modificados, cultivar colonias individuales de dicha E. coli transformada y valorar cada colonia para la producción de policétido.

12. Procedimiento para valorar la producción de policétido en una célula huésped que contiene un gen policétido sintasa (PKS) transpuesto, comprendiendo dicho procedimiento: