Uso de las isoformas de Apo J como biomarcadores de lesión tisular.

La invención se refiere al uso de las formas glicosiladas de la Apolipoproteína J como marcadores de daño tisular, más concretamente producido de infarto agudo de miocardio, así como a un método de diagnóstico de dicho daño y a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho diagnóstico. En la presente invención se demuestra que las diversas formas glicosiladas varían su expresión si existe daño tisular lo que permite utilizarlas como marcadores en caso de existir este daño.

Uso de las isoformas de Apo J como biomarcadores de lesión tisular.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere al uso de las formas glicosiladas de la Apolipoproteína J como marcadores de daño tisular, más concretamente producido de infarto agudo de miocardio, así como a un método de diagnóstico de dicho daño y a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho diagnóstico.

Estado de la técnica anterior

El infarto agudo de miocardio es una de las mayores causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Multitud de los hábitos de vida actuales representan factores de riesgo para esta enfermedad como por ejemplo la obesidad, el tabaquismo, los elevados niveles de colesterol, etc. Esta patología provoca daños en el tejido cardíaco los cuales se mantienen tras el evento inicial. Debido a la imposibilidad de realizar biopsias en dicho tejido, se hace necesaria la obtención de marcadores que sirvan para diagnosticar el alcance de dicho daño.

Se han propuesto como marcadores de este daño múltiples proteínas, muchas de las cuales se encuentran implicadas en la formación de placas de ateroma o metabolismo de lípidos como por ejemplo las lipoproteínas de alta densidad. Además de éstas, también se han propuesto proteínas que se asocian con dichas lipoproteínas como la apolipoproteína A-I o la apolipoproteína J (Apo J).

Esta Apo J (clusterina, TRPM2, CLI, NA1/NA2, ku70-binding protein 1, Aging-associated gene 4 protein, o SP-40,40) se asocia a las HDL mediante la unión a Apo A-I (Stuart et al. 1992, Biochemistry, 31: 8552-8559). Apo J fue inicialmente descrita como una glicoproteína heterodimérica, secretada por células de Sertoli de ratas, cultivadas in vitro. El producto de la traducción es un precursor de cadena simple el cual sufre una digestión dando lugar a dos subunidades, una de 34 kDa y otra de 47 kDa. Se ha demostrado que Apo J presenta diversas N-glicosilaciones que llevan asociados azúcares complejos los cuales contribuyen a entre un 20% y un 30% del peso total de Apo J.

Dicha proteína ha sido asociada con multitud de procesos celulares que tienen como resultado por ejemplo efectos citoprotectores (Schwochau et al. 1998, Kidney Int; 53: 1647-1653), antiinflamatorios (McLaughlin et al. 2000, J Clin Invest; 106: 1105-1113), o antiapoptóticos (Zhang et al. 2005, Nat Cell Biol; 7: 909-915). Apo J además, se une a multitud de moléculas con elevada afinidad incluyendo tanto lípidos como péptidos o proteínas.

Por otro lado, también se ha descrito que Apo J presenta diferentes actividades en función del momento del ciclo celular en el que actúe (Trougakos et al. 2005, Free Radic Biol Med; 38: 436-449).

Apo J también ha sido relacionada con diversas patologías como pueden ser, por ejemplo, la diabetes o diferentes tipos de cáncer. Esta proteína también es abundante en enfermedades ateroscleróticas.

Por otro lado, Apo J ha sido relacionada con enfermedades cardíacas coronarias. Esta última relación no se encuentra muy bien definida ya que existen datos respecto tanto a un aumento como a una disminución de dicha proteína en caso de existir una patología cardíaca coronaria (Trougakos et al. 2002, Exp Gerontol; 37: 1175-1187; Kujiraoka et al. 2006, J Atheroscler Thromb; 13: 314-322). Esta controversia o variedad de datos provoca que los niveles totales en suero y/o plasma de dicha proteína no sean un buen marcador de daño cardíaco ya que su respuesta no es constante cuando se da un evento vascular.

Esto hace que sea necesaria la búsqueda de nuevos marcadores de daño tisular más fiables que Apo J y que no presenten este inconveniente.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere al uso de las formas glicosiladas de la Apolipoproteína J, preferiblemente de los conjuntos Apo J-15 y Apo J-29, como marcadores de daño tisular, más concretamente de daño cardíaco producido por infarto agudo de miocardio. También se refiere a un método de diagnostico de dicho daño y al kit que comprende los elementos necesarios para la realización de dicho método.

En la presente invención se demuestra como en pacientes que han sufrido un síndrome coronario agudo la cantidad de Apo J total se encuentra alterada respecto a individuos que no han sufrido este evento. Dicha Apo J presenta diferentes isoformas con diversos estados de glicosilación. La cantidad de Apo J total puede variar enormemente en un mismo evento entre diversos individuos ya que algunas de sus isoformas aumentan mientras otras disminuyen, y no en todos los individuos las proporciones de las mismas son iguales. Por ello la detección de Apo J total no es un marcador adecuado para el diagnóstico de daño tisular. Este problema se puede solventar mediante la detección de una única isoforma glicosilada o de grupos de isoformas que respondan de igual forma en todos los individuos y en la misma enfermedad.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de al menos una isoforma glicosilada de Apo J como marcador de daño tisular.

En la presente invención se entiende por "daño tisular" aquel daño que se genera en un tejido y que supone una alteración en el mismo de su situación fisiológica, ya sea en estructura o en función. Este daño tisular para el que es útil el uso de las formas glicosiladas de Apo J se da en tejidos que se seleccionan de la lista que comprende, tejido cardíaco, tejido vascular o tejido renal.

La proteína Apolipoproteína J o Apo J (también denominada clusterina, TRPM2, CLI, NA1/NA2, ku70-binding protein 1, Aging-associated gene 4 protein, o SP-40,40), se encuentra codificada en Homo sapiens por el gen CLU con número de identificación en el GenBank 1191. Esta proteína incluye tanto las formas sin glicosilar como las formas glicosiladas. Existen 2 formas conocidas de esta proteína generadas por diferentes ARNm a partir del mismo gen. La isoforma 1 es traducida a partir del ARNm con número de acceso al GenBank NM_001831. La isoforma 2 es traducida a partir del ARNm con número de acceso al GenBank NM_203339.

En la presente invención se entiende por "Apo J total" la cantidad de Apo J presente incluyendo sus diversas isoformas y diferentes estados de glicosilación.

Se entiende por "isoforma glicosilada de Apo J" o "forma glicosilada de Apo J" en la presente invención aquella proteína cuya secuencia de aminoácidos es igual a Apo J, y que presenta unido al menos un azúcar en cualquiera de sus aminoácidos mediante un enlace N-glicosídico u O-glicosídico.

Existen multitud de estados de glicosilación de Apo J ya sea en cuanto a cantidad de aminoácidos glicosilados, como a la composición en azúcares de dichas glicosilaciones. Estas variaciones le confieren a las diferentes formas glicosiladas de Apo J diversas características en cuanto a tamaño y punto isoeléctrico (pl). El peso molecular varía en función de la glicosilación desde los 37,1 a los 47,3 kDa, y el punto isoeléctrico de 4,6 a 5. Cada una de dichas formas presenta diferentes características y diversos patrones de expresión en función del estado fisiológico de cada individuo.

En el caso de daño tisular, existen grupos de formas que se comportan de igual forma, es decir aumentando o disminuyendo, en la misma patología en todos los individuos. Como se demuestra en la figura 2 de la presente invención, los spots de las formas glicosiladas que presentan una mayor variación y por lo tanto una mayor utilidad para el diagnóstico son las formas correspondientes a los spots 6 y 9 (Apo J-15) las cuales disminuyen, y a los spots 3, 7, 8 y 11 (Apo J-29), los cuales aumentan. Por tanto, los spots que conforman el grupo Apo J-15 son el spot número 6 que se corresponde con una forma glicosilada de Apo J con un peso molecular de aproximadamente 43,2 kDa y un punto isoeléctrico (pl) de aproximadamente 4,8 en una electroforesis bidimensional, y el spot número 9 que se corresponde con una forma glicosilada de Apo J con un peso molecular de aproximadamente 41,2 kDa y un punto isoeléctrico (pl) de aproximadamente 4,9 en una electroforesis bidimensional. En los ejemplos de la presente invención se muestra que ambos spots sufren una reducción superior al 50% en caso de daño tisular.

Por su parte Apo J-29 engloba cuatro formas glicosiladas... [Seguir leyendo]

1. Uso de al menos una forma glicosilada de Apo J como marcador de un daño tisular.

2. Uso según la reivindicación 1 donde las formas glicosiladas de Apo J se seleccionan del conjunto Apo J-15 y/o del conjunto Apo J-29.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde las formas glicosiladas son todas las del conjunto Apo J-15 y/o todas las del conjunto Apo J-29.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el daño tisular es un daño cardíaco.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el daño es producido por infarto agudo de miocardio.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el daño tisular es un daño renal.

7. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico o monitorización del tratamiento de un daño tisular que comprende los siguientes pasos:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar la cantidad de al menos una forma glicosilada de Apo J en la muestra obtenida en el paso (a).

8. Método según la reivindicación 7 que además comprende un paso:

c) comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia obtenida de una muestra control.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde la forma glicosilada de Apo J que se detecta en el paso (a) se selecciona del conjunto Apo J-15 y/o del conjunto Apo J-29.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde en el paso (a) se detectan todas las formas glicosiladas del conjunto Apo J-15 y/o todas las del conjunto Apo J-29.

11. Método de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 que además comprende un paso adicional (d) donde una cantidad de al menos una de las formas glicosiladas del conjunto Apo J-15 detectadas en el paso (b) menor que la cantidad de referencia del paso (c) y/o donde una cantidad de al menos una de las formas glicosiladas del conjunto Apo J-29 detectadas en el paso (b) mayor que la cantidad de referencia del paso (c) son indicativas de un daño tisular.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde el daño tisular es un daño cardíaco.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 donde el daño es producido por infarto agudo de miocardio.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde el daño tisular es un daño renal.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 donde la detección de la cantidad de la forma glicosilada de Apo J del paso (b) se lleva a cabo mediante electroforesis bidimensional.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 donde la detección de la cantidad de la forma glicosilada de Apo J del paso (b) se lleva a cabo mediante un inmunoensayo.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16 donde la muestra biológica aislada del paso (a) se selecciona de la lista que comprende tejido cardíaco, suero, sangre, plasma o tejido renal.

18. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17 que comprende los elementos necesarios para:

a) detectar la cantidad de al menos una forma glicosilada de Apo J en una muestra biológica aislada obtenida de un individuo, y

b) comparar la cantidad detectada con una cantidad de referencia obtenida de una muestra control.

19. Kit según la reivindicación anterior donde las formas glicosiladas a detectar se seleccionan del conjunto Apo J-15 y/o del conjunto Apo J-29.

20. Kit según la reivindicación anterior donde las formas glicosiladas a detectar son todas las del conjunto Apo J-15 y/o todas las del conjunto Apo J-29.