Un polipéptido IdeS o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS para usar en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG,

en el que la enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de transplante, tratamiento postoperatorio o hemofilia adquirida, y en el la enfermedad autoinmunitaria se selecciona de enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípidos, anemia aplásica, gastritis autoinmunitaria, hipoacusia autoinmunitaria, anemias hemolíticas autoinmunitarias, hepatitis autoinmunitaria, hipoparatiroidismo autoinmunitaria, hipofisitis autoinmunitaria, enfermedad del oído interno autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, miocarditis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, poliendocrinoparía autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, síndrome de CREST, enfermedad de Degos, epidemólisis ampollosa adquirida, crioglobulinemia mixta esencial, arteritis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Gillan-Barre, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Meniere, enfermedad del tejido conjuntivo mixta, úlcera de Mooren, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 1 (PAS-1), síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 2 (PAS-2), síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 3 (PAS-3), polimiositis/dermatomiositis, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, síndrome de Raynaud, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjörgren, tiroiditis subaguda, oftalmia simpática, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takatasu, diabetes mellitus de tipo 1, vitíligo, enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harda o granulomatosis de Wegener.

Uso de la proteinasa IdeS (de S. pyogenes) para tratar enfermedades autoinmunitarias y rechazo de injerto Campo de la invención La presente invención se refiere al tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones medidas por anticuerpos IgG, tales como enfermedades autoinmunitarias, rechazo de transplantes, tratamiento postoperatorio y hemofilia adquirida.

Antecedentes de la invención

La IdeS (enzima de degradación de inmunoglobulina G de S. pyogenes) es una cisteína proteasa extracelular producida por el patógeno humano S. pyogenes. Inicialmente la IdeS se aisló de una cepa de estreptococos del grupo A de serotipo M1, pero el gen ¡des se ha identificado ahora en todas las cepas de estreptococos del grupo A sometidas a ensayo. La IdeS tiene un grado extraordinariamente alto de especificidad de sustrato, siendo su único sustrato identificado la IgG. La IdeS cataliza una única escisión proteolítica en la región bisagra inferior de la IgG humana. Esta degradación proteolítica estimula la inhibición de la opsonofagocitosis e interfiere en la muerte de Streptococcus del grupo A. La IdeS también escinde algunas subclases de la IgG en varios animales y convierte de forma eficaz la IgG en fragmentos Fc y Fab. El gen ides ha sido clonado y expresado en E. coli como una proteína de fusión GST.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han demostrado que la IdeS es útil en el tratamiento y prevención de enfermedades mediadas por anticuerpos IgG. En particular, los inventores han demostrado que la IdeS se puede usar para tratar la artritis reumatoide (AR) . La administración de IdeS a ratones con artritis reumatoide inducida no tuvo ningún efecto tóxico observable y previno completamente el desarrollo de artritis reumatoide. Además, los inventores han demostrado que el efecto de la IdeS es altamente potente y que la IdeS tiene efectos locales.

De acuerdo con la presente invención se proporciona el uso de un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG como se define en la reivindicación 1.

La presente invención también proporciona:

un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG como se define en la reivindicación 1; Y un procedimiento de tratar, ex vivo, sangre extraída de un paciente que sufre una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG, que comprende poner en contacto la sangre con un polipéptido IdeS.

Breve descripción de las figuras

45 La Figura 1 muestra la incidencia (a) y la gravedad (b) de la artritis en ratones que reciben IdeS y ratones control. El tiempo O es la inyección de anticuerpos anti-CII. Se inyectó a los ratones IdeS (0, 950 mg/ratón/i.v.) en PBS 3 horas antes (n= 5) o después (n= 5) de la transferencia de anticuerpo o sin ningún tratamiento (n= 6) . El día 5 se inyectó LPS (25 ) .lg/ratón/i.p.) en todos los ratones. Se monitorizó a los ratones para detectar desarrollo de artritis diariamente durante 15 días. Todos los ratones se usaron para los cálculos, n indica el número de ratones usados en los experimentos. Se extrajo suero y se retiraron las patas de los animales. La Figura 2 muestra secciones histopatológicas de patas tomadas de los ratones control (a y c) y ratones tratados con IdeS como se describe para la Figura 1 (b Y d) . Las patas de ratón se recogieron el día 15 del experimento. Las patas traseras se fijaron en solución al 4 % de paraformaldehído tamponado con fosfato (pH

55 7, 4) a 4 oC durante 24 horas, se descalcificaron durante 4 semanas en una solución de ácido etilendiaminotetraacético que contiene polivinilpirrolidona y Tris 0, 1 M (pH 6, 95) , se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Secciones de 6 ) .lm se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los resultados mostrados son representativos de los obtenidos de los ratones de cada grupo. Los aumentos originales fueron x 20. La Figura 3 muestra la incidencia (a) y la gravedad (b) de la artritis en ratones que reciben varias dosis de IdeS y ratones control. En grupos de ratones B10.RII macho de cuatro meses de edad se inyectó i.v. 9 mg de anticuerpos monoclonales específicos de CII, M2139 y CIIC1, a O horas el día O. Tras 3 horas, el mismo día se inyectó Lv. O) .lg (n= 7) , 10) .lg (n= 5) , 1ºo) .lg (n= 5) y 1000) .lg (n= 5) de IdeS en PBS. El día 5, todos los ratones recibieron LPS (25 ) .lg/i.p.) . n indica el número de ratones en cada grupo. Las barras de error indican la media ± SEM. Se incluyó a todos los ratones para los cálculos.

65 La Figura 4 muestra la incidencia (a) y la gravedad (b) de la artritis en ratones que reciben IdeS sistémica y localmente y ratones control. En grupos de ratones B10.RIII se transfirió i.v. 9 mg de un cóctel de anticuerpo monoclonal IgG2a anti-CII artritogénico. Se trató a los ratones con 100 I"g de IdeS sistémicamente (Lv.) (n=4) o localmente (pata izquierda o derecha) . A los ratones tratados localmente se administró IdeS 3 horas después de la transferencia del anticuerpo anti-CII (n= 6) o 3 y 24 horas después de la transferencia del anticuerpo anti-CII (n= 6) .

Breve descripción de las secuencias

La SEC ID N° 1 es una secuencia de aminoácidos que codifica la IdeS aislada de S. pyogenes AP1.

La SEC ID N° 2 es una secuencia de aminoácidos que codifica la IdeS aislada de S. pyogenes AP1, que incluye una secuencia señal putativa.

La SEC ID N° 3 es una secuencia de ácido nucleico que codifica la IdeS aislada de S. pyogenes AP1, (que incluye una secuencia señal) . 15 La SEC ID N° 4 es un cebador Ide1 para PCR.

La SEC ID N° 5 es un cebador Ide2 para PCR.

La SEC ID N° 6 es un cebador Ide5x para PCR.

La SEC ID N° 7 es un cebador Ide3x para PCR.

La SEC ID N° 8 es la secuencia de aminoácidos en N terminal de un producto de escisión de IgG humana con IdeS.

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un polipéptido IdeS o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS para usar en un procedimiento para tratar o prevenir enfermedades o afecciones mediadas por anticuerpos IgG como se define en la reivindicación 1.

Polipéptidos El polipéptido IdeS es, preferentemente, IdeS de S. pyogenes, o variantes o fragmentos de IdeS de S. pyogenes que conserven la actividad de cisteína proteasa. La variante puede ser un polipéptido IdeS de otro organismo, tal como otra bacteria. Preferentemente, la bacteria es un Streptococcus. El Streptococcus es, preferentemente, un Streptococcus del grupo A, un Streptococcus del grupo C o un Streptococcus del grupo G. En concreto, la variante puede ser un polipéptido IdeS de un Streptococcus del grupo C, tal como S. equii o S. zooepidemicus. Como alternativa, la variante puede proceder de Pseudomonas putida.

El polipéptido IdeS puede comprender:

(a) la secuencia de ácido nucleico de SEC ID N° 1;

(b) una variante del mismo que tenga una identidad de al menos el 50 % con la secuencia de aminoácidos de 45 la SEC ID N° 1 Yque tenga actividad de cisteina proteasa de IgG; o (c) un fragmento de cualquiera de ellos que tenga actividad de cisteína proteasa de IgG.

Preferentemente, el polipéptido comprende, o consiste en, la secuencia de SEC ID N° 1. Adicionalmente, el polipéptido puede incluir una secuencia señal. De acuerdo con esto, el polipéptido IdeS puede comprender:

(a) la secuencia de ácido nucleico de SEC ID N° 2;

(b) una variante del mismo que tenga una identidad de al menos el 50 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 2 Y que tenga actividad de cisteina proteasa de IgG; o

(c) un fragmento de cualquiera de ellos que tenga actividad de cisteína proteasa de IgG.

El polipéptido IdeS puede consistir en, la secuencia mostrada en la SEC ID N° 2.

Polipéptidos variantes son aquéllos para los que la secuencia de aminoácidos varía de la observada en la SEC ID N° 1 o la SEC ID N° 2, pero que conservan el mismo carácter esencial o funcionalidad básica que IdeS. Los polipéptidos variantes pueden mostrar actividad cisteína proteasa de IgG. Normalmente, los polipéptidos con una identidad superior a aproximadamente 50%, 55% o 65%, preferentemente de al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % Y particularmente... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido IdeS o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS para usar en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG, en el que la enfermedad o 5 afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de transplante, tratamiento postoperatorio o hemofilia adquirida, y en el la enfermedad autoinmunitaria se selecciona de enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípidos, anemia aplásica, gastritis autoinmunitaria, hipoacusia autoinmunitaria, anemias hemolíticas autoinmunitarias, hepatitis autoinmunitaria, hipoparatiroidismo autoinmunitaria, hipofisitis autoinmunitaria, enfermedad del oído interno autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, 10 miocarditis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, poliendocrinoparía autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, síndrome de CREST, enfermedad de Oegos, epidemólisis ampo llosa adquirida, crioglobulinemia mixta esencial, arteritis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Gillan-Barre, tiroiditis de 15 Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Meniere, enfermedad del tejido conjuntivo mixta, úlcera de Mooren, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 1 (PAS-1) , sindrome autoinmunitario poliglandular de tipo 2 (PAS-2) , sindrome autoinmunitario poliglandular de tipo 3 (PAS-3) , polimiositisldermatomiositis, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, síndrome de Raynaud, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjórgren, tiroiditis subaguda, oftalmia simpática, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takatasu, diabetes mellitus de tipo 1, vitíligo, enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harda o granulomatosis de Wegener.

2. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de 25 acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido IdeS comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 1;

(b) una variante del mismo que tenga una identidad de al menos el 50 % con la secuencia de aminoácidos de

la SEC ID N° 1 Y que tenga actividad de cisteina proteasa de IgG; o 30 (c) un fragmento de cualquiera de ellos que tenga actividad de cisteína proteasa de IgG.

3. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido consiste en la secuencia mostrada en la SEC ID N° 1.

35 4. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido comprende:

(a) la secuencia de codificación de SEC ID N° 3;

(b) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético con la secuencia como se define 40 en (a) ;

(c) una secuencia que tienen una identidad de al menos 60 % con la secuencia como se define en (a) o (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad cisteína proteasa de IgG; o

(d) un fragmento de una cualquiera de las secuencias como se define en (a) , (b) o (c) que codifica un

polipéptido que tiene actividad cisteína proteasa de IgG. 45

5. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido consiste en la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID N° 3.

50 6. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento comprende:

poner en contacto, ex vivo, la sangre extraída de un paciente con un polipéptido IdeS, en el que la sangre se ha de devolver al paciente.

7. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.

8. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de

60 acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico.

9. Un polipéptido IdeS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido IdeS, para usar en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho rechazo de transplante es rechazo 65 de aloinjerto o xenoinjerto.

10. Un procedimiento de tratar, ex vivo, sangre extraída de un paciente que sufre una enfermedad o afección mediada por anticuerpos IgG, como se define en la reivindicación 1, que comprende poner en contacto la sangre con un polipéptido IdeS.

Figura 1

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Figura 3

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