Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, en donde dicho Hsp70 o un fragmento o variantefuncionales del mismo puede interaccionar con BMP (bis(monoacilglicero)fosfato),

para su uso en el tratamiento deun trastorno de almacenamiento lisosómico.

Uso de Hsp70 como regulador de la actividad enzimática Esta solicitud es una solicitud no provisional de la solicitud de patente de DK PA 2008 00885 presentada el 26 de junio de 2008.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la modulación de la actividad enzimática aprovechando la interacción entre la chaperona molecular Hsp70 y el fosfolípido lisosómico bis (monoacilglicero) fosfato (BMP, también conocido con el nombre de LBPA) . La interacción de Hsp70-BMP modula la actividad de enzimas del compartimento lisosómico que interaccionan con BMP y, por tanto, la presente invención proporciona un medio para revertir la patología de enfermedades de almacenamiento lisosómico.

Antecedentes de la invención

Las chaperonas moleculares se encuentran en todos los compartimentos de una célula donde se producen reordenamientos conformacionales de proteínas y, aunque la síntesis de proteínas es la fuente principal de péptidos no plegados en la célula, la exposición de la célula a temperatura alta u otros estímulos que puedan hacer a las proteínas estructuralmente lábiles y, por lo tanto, propensas a no plegarse y agregarse, se supera con una respuesta celular específica que implica la producción de proteínas protectoras. Esta respuesta es un fenómeno observado en todos los tipos de células, desde las procariotas hasta las eucariotas, y se hace referencia a ella como la respuesta de choque térmico o de estrés. Las proteínas inducidas por esta respuesta se conocen como las proteínas de choque térmico (HSP) , de las cuales existen varias familias.

Un ejemplo principal de una familia de chaperonas son las proteínas Hsp70. Esta familia se ha implicado recientemente en otros aspectos de la homeostasis celular además de funcionar como chaperona, principalmente a través de sus características anti-apoptósicas, sus funciones en inmunidad y la aparente dependencia de las células cancerosas de la regulación por incremento de Hsp70. Además, la Hsp70 puede desempeñar un papel de protección de la integridad lisosómica. Sin embargo, su mecanismo molecular ha permanecido sin aclarar.

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico son un grupo de enfermedades raras, caracterizadas por la acumulación de sustancias en el compartimento lisosómico y su consiguiente desestabilización, con un efecto resultante devastador para los individuos afectados. Las sustancias se acumulan en el compartimento lisosómico debido a deficiencias en las enzimas implicadas en su catabolismo.

Hasta el momento, no se dispone de ningún tratamiento para la mayoría de las enfermedades de almacenamiento lisosómico. La causa subyacente de este grupo de enfermedades es la incapacidad de enzimas lisosómicas específicas de catabolizar de manera eficaz sustancias lisosómicas específicas tales como lípidos. Por lo tanto, el uso del tratamiento de restitución de enzimas (ERT) , proporcionando al paciente la enzima recombinante, se ha empleado para un subconjunto de estas enfermedades, incluidas las enfermedades de Gaucher y de Fabr y . Sin embargo, el ERT es una forma muy cara de tratamiento, lo que puede limitar su uso en algunas zonas, y también es eficaz sólo frente al tipo específico de enfermedad para la que se ha producido la enzima recombinante. La presente invención tiene como objetivo proporcionar nuevos medios para tratar los trastornos de almacenamiento lisosómico.

Sumario de la invención

En la presente invención, se divulgan las bases moleculares de la contribución de la Hsp70 a la estabilidad de la membrana lisosómica, proporcionando una interpretación de las bases moleculares para la asociación entre Hsp70 y las membranas celulares, en particular las membranas plasmáticas y lisosómicas.

Se conoce por la literatura que la Hsp70 puede desempañar un papel en la protección de la integridad lisosómica. Sin embargo, su mecanismo molecular ha permanecido sin aclarar. Además, la cuestión de si esta cualidad es específica para la Hsp70 inducible por estrés principal (HspA1A/A1B -denominada Hsp70 a lo largo de este estudio)

o si otros miembros de la familia Hsp70 podrían tener la misma característica tampoco se había abordado.

Estas preguntas sin responder inspiraron uno de los principales objetivos de esta invención, que era estudiar las bases moleculares del efecto protector de lisosomas de Hsp70. Con este fin, se ideó un procedimiento para la producción de la Hsp70 recombinante y sus mutantes, así como un protocolo de fraccionamiento subcelular a base de ultracentrifugación con un gradiente de iodixanol. Se estableció un ensayo para la evaluación directa de la integridad de la membrana lisosómica basado en la permeabilización de lisosomas inducida por fotooxidación, lo que permitió un enfoque microscópico en tiempo real para evaluar el efecto de Hsp70 y otros componentes con respecto a su capacidad para sensibilizar o proteger las membranas lisosómicas. La interacción de Hsp70 recombinante y mutantes con diversos los lípidos se estudió en diferentes sistemas in vitro , incluyendo medidas de dispersión de luz a 90º de liposomas, desplazamientos de fluorescencia por triptófano y resonancia de plasmón superficial (BIAcore) . La creación de un modelo conceptual para la interacción de Hsp70-BMP se facilitó mediante modelización de superficie electrostática de Hsp70 in silico. Con el fin de comprobar la importancia in vivo de la interacción de lípidos observada en los sistemas in vitro, se marcó la interacción de BMP-Hsp70 con respecto a ambos componentes. Para demostrar adicionalmente la factibilidad de aprovechar este mecanismo, se caracterizó el modo de muerte celular inducida por la la administración de cisplatino y se marcó la Hsp70 en este sistema de muerte celular en líneas celulares tanto cancerosas como no transformadas.

Con el fin de abordar las bases moleculares para la contribución de la Hsp70 a la estabilidad de la membrana lisosómica, los inventores trataron de establecer un sistema que eliminara la influencia de la Hsp70 citosólica, es decir, fue necesario dirigir la Hsp70 directamente a los lisosomas. La imágenes de microscopía electrónica por Nylandsted et al. mostraron que la Hsp70 podría estar presente dentro de los lisosomas y, por tanto, se decidió establecer un procedimiento para la producción de Hsp70 humana recombinante (rHsp70) con la esperanza de aprovechar la maquinaria endocítica como ruta de administración de la rHsp70 directamente a los lisosomas. Los presentes inventores sortearían de este modo la necesidad de añadir señales de clasificación lisosómica a la Hsp70, alterando potencialmente la función y evitando complicaciones que podrían surgir debido a la sobreexpresión. Además, un enfoque endocítico permitiría una valoración de las cantidades de rHsp70 y en una perspectiva a más largo plazo, abre posibilidades para estudiar el mecanismo de incorporación de Hsp70 extracelular.

Una vez establecido el procedimiento de producción de Hsp70, se marcó con el fluoróforo Alexa Fluor 488 (Hsp70AF488) con el fin de comprobar su endocitosis. La formación de imágenes confocales reveló que, en efecto, la rHsp70 podía dirigirse a lisosomas de esta manera. Con el fin de evaluar el impacto sobre la estabilidad de las membranas lisosómicas, los inventores idearon un procedimiento para cuantificar las permeabilización de la membrana lisosómica a nivel de lisosomas solos y utilizaron este procedimiento para evaluar el efecto de la rHsp70 endocitada. Estos procedimientos constituyeron la base para los ejemplos 1 y 2, en los que los inventores muestran que la Hsp70 potencia la supervivencia celular mediante la estabilización de los lisosomas a través de una unión de alta afinidad dependiente de pH al fosfolípido aniónico endolisosómico bis (monoacilglicero) fosfato (BMP) . El dominio ATPasa cargado positivamente de la Hsp70 es responsable de la unión, pero el dominio de unión de sustrato también es necesario para la estabilización eficaz de los lisosomas. Es interesante el hecho de que esta interacción, y la protección que ofrece, dependen del triptófano 90, que se sitúa en la cuña cargada positivamente del dominio ATPasa. Es importante el hecho de que el efecto citoprotector podría obtenerse mediante la administración de rHsp70 endocítica y revertirse mediante administración extracelular de anticuerpos frente a BMP o inhibidores de Hsp70.

Además de esto, los inventores también trataron de acoplar el mecanismo de la protección de la Hsp70 de membranas lisosómicas a los acontecimientos de tumorigénesis y muerte celular programada.... [Seguir leyendo]

1. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, en donde dicho Hsp70 o un fragmento o variante funcionales del mismo puede interaccionar con BMP (bis (monoacilglicero) fosfato) , para su uso en el tratamiento de un trastorno de almacenamiento lisosómico.

2. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, tiene una homología del 100 % con la proteína Hsp70 salvaje.

3. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, tiene una homología de entre el 99, 9 y el 95 %, por ejemplo, una homología del 95 al 90 %, tal como una homología del 90 al 85 %, por ejemplo, una homología del 85 al 80 %, tal como una homología del 80 al 75 %, por ejemplo, una homología del 75 al 60 % con la proteína salvaje.

4. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, es Hsp70.

5. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha Hsp70 es Hsp70 de longitud completa.

6. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Hsp70 o fragmento o variante funcionales de Hsp70 comprende todo o parte del dominio ATPasa de Hsp70.

7. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha Hsp70 o fragmento o variante funcionales de Hsp70 comprende triptófano en la posición aminoacídica 90 del dominio ATPasa de Hsp70.

8. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho trastorno de almacenamiento lisosómico se selecciona del grupo que consiste en los trastornos de Niemann-Pick, Farber, Krabbe, Fabr y , Gaucher, sialidosis, leucodistrofia metacromática y deficiencia de saposina.

9. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho trastorno de almacenamiento lisosómico es la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o de tipo B.

10. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad de almacenamiento lisosómico se caracteriza por tener una actividad enzimática residual de la enzima defectuosa implicada en la patología de la enfermedad.

11. Hsp70, o un fragmento o variante funcionales del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha actividad enzimática residual está en el intervalo de desde el 0, 1 % al 50 %, tal como en el intervalo del 0, 1 al 1 %, por ejemplo, del 1 al 2 %, tal como del 2 al 3 %, por ejemplo, del 3 al 4 %, tal como del 4 al 5 %, por ejemplo, del 5 al 6 %, tal como del 6 al 7 %, por ejemplo, del 7 al 8 %, tal como del 8 al 9 %, por ejemplo, del 9 al 10 %, tal como del 10 al 11 %, por ejemplo, del 11 al 12 %, tal como del 12 al 13 %, por ejemplo, del 13 al 14 %, tal como del 14 al 15 %, por ejemplo, del 15 al 20 %, tal como del 20 al 25 %, por ejemplo, del 25 al 30 %, tal como del 30 al 35 %, por ejemplo, del 35 al 40 %, tal como del 40 al 45 %, por ejemplo en el intervalo del 45 al 50 % de la actividad enzimática residual.

12. Hsp70, o un fragmento funcional del mismo, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. Un fragmento funcional de Hsp70 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6-11.

14. Una variante funcional de Hsp70 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6-11.