USO DE DERIVADOS DE FENOBARBITAL EN INMUNOENSAYOS.

La presente invención se refiere al campo del control terapéutico de los fármacos y en particular a derivados de fenobarbital y a métodos de ensayo en los que dichos derivados se usan para determinar fenobarbital en muestras de pacientes. Antecedentes de la presente invención El problema superado por la presente invención es el desarrollo de un inmunoensayo mejorado de aglutinación de micropartículas, no isotópico y homogéneo, específico para el control terapéutico del fármaco fenobarbital, sin reactividad cruzada con otras sustancias de la misma clase de fármacos (barbitúricos), que se basa en la interacción cinética de micropartículas (KIMS). En otros inmunoensayos no isotópicos específicos del fenobarbital se han usado distintas tecnologías, tales como el inmunoensayo de fluorescencia polarizada (FPIA), p.ej. Kirkemo y otros, US 4,614,823; inmunoensayos con señal generada mediante enzimas, p.ej. Bogulaski y otros, US 4,279,992 (EIA); Flentge y otros, US 4,543,412 (EIA); Carrico y otros, US 4,255,566 (derivados de flavina-fenobarbital para EIA); Greenquist, US 4,363,874 (EIA sobre una membrana); Scholz y otros, Recent Dev. Ther. Drug Monit. Clin. Toxicol., 1992, 375-381 (CEDIA); y el inmunoensayo quimioluminiscente, p.ej. Adamczyk y otros, Bio-conjugate Chem., 2000, 11, 714-724 (derivados C6-OCONH-R en posición 5), aunque también se han empleado otros métodos más esotéricos. Existen ensayos para barbituratos, como grupo, en que el fenobarbital tiene reactividad cruzada. (Adamczyk y otros, US Pat. 6,472,227 [usando derivados sec-butílicos y ciclopentílicos de barbituratos]; Grote & Hu, US Pats. 5,099,020 y 5,096,838 [FPIA con derivados 5,5-dialquílicos de barbiturato, aunque en la descripción y en las reivindicaciones se incluye un derivado de fenobarbital]. También hay un ensayo de aglutinación de micropartículas para la clase de los barbituratos (US 5,618,926), pero con un conjugado de secobarbital-BSA inmovilizado sobre micropartícula (a distinción del conjugado análogo de fenobarbital-aminodextrano en formato disuelto de la presente invención). El fenobarbital es uno de los muchos que tienen reactividad cruzada en el ensayo. Buechler (US 5,414,085) describe compuestos barbitúricos, incluyendo sustancias sustituidas en 5-arilo, también sintetizadas a partir de la posición 5 con un extremo terminado en tiolactona, aunque en la práctica se refiere a derivados de secobarbital. En las patentes US 5,284,948, US 5,298,403, EP 517327 y US 5,601,994 se revelan derivados de fenobarbital con una cadena a partir del N1 del núcleo de barbiturato, es decir, a partir del nitrógeno en posición 1 y no a partir del carbono en posición 5, como es el caso de los compuestos de la presente invención. Ver el diagrama siguiente. La patente citada en último lugar también describe un inmunoensayo enzimático para barbituratos, pero ejemplificando solo el fenobarbital y sus derivados, sin indicación de reactividades cruzadas de otros barbituratos en el ensayo. Las patentes US 5,284,948 y US 5,298,403 también se refieren a la unión de derivados de fenobarbital marcados con enzima, que se establece a partir de las sustancias derivadas del N1, arriba representadas, con anticuerpos inmovilizados sobre perlas extruidas/peletizadas en una etapa aparte, mientras que la patente EP 517327 revela un inmunoensayo enzimático con el empleo de anticuerpos inmovilizados sobre una membrana. Resumen de la presente invención Respecto a dichos antecedentes, la presente invención aporta ciertas ventajas y avances no aparentes sobre el estado técnico precedente. En concreto, los inventores han reconocido la necesidad de mejorar los derivados de fenobarbital utilizables en inmunoensayos. Los inventores han encontrado que los derivados de fenobarbital sintetizados a partir de la cadena alquílica en la posición 5 - en particular con propiedades hidrófilas y un éster activo en el extremo - permiten la formación de unos 2   conjugados con aminodextrano que dan curvas dentro del intervalo deseado en el ensayo ONLINE TDM (Roche Diagnostics Operations, Inc.) con formato de micropartículas, al compararlo con el ensayo FPIA (inmunoensayo de fluorescencia polarizada) de anticuerpo específico del fenobarbital (un anticuerpo específico para el fenobarbital), de Roche. Una forma de ejecución de la presente invención se refiere a un compuesto que tiene la estructura donde n es 4-6, m es 1-4, R es -NHCO- o -CONH-, L es un grupo conector que lleva 2-18 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos dispuestos en una cadena lineal o ramificada y que contiene hasta 1 estructura cíclica, a condición de que el primer átomo unido a R sea de carbono, y Z es un grupo saliente o un polisacárido. Otra forma de ejecución de la presente invención se refiere a un compuesto que tiene la estructura donde n es 4-6, L es un grupo conector que lleva 2-18 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos dispuestos en una cadena lineal o ramificada y que contiene hasta 1 estructura cíclica, con la condición de que el primer átomo unido a -CONH- sea de carbono, y Z es un grupo saliente o un polisacárido. Otra forma de ejecución de la presente invención es un análogo de fenobarbital que tiene la estructura Otra forma de ejecución de la presente invención es un análogo de fenobarbital que tiene la estructura Otra forma de ejecución de la presente invención es un análogo de fenobarbital que tiene la estructura 3 , ,   Otra forma de ejecución de la presente invención es un análogo de fenobarbital conjugado que tiene la estructura donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un análogo de fenobarbital conjugado que tiene la estructura donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un análogo de fenobarbital conjugado que tiene la estructura donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un kit de ensayo, para determinar fenobarbital en una muestra, que contiene en un paquete combinado micropartículas recubiertas con un anticuerpo específico del fenobarbital, instrucciones para efectuar la determinación y un análogo de fenobarbital conjugado según la fórmula: 4 , , ,   donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un kit de ensayo, para determinar fenobarbital en una muestra, que contiene en un paquete combinado micropartículas recubiertas con un anticuerpo específico del fenobarbital, instrucciones para efectuar la determinación y un análogo de fenobarbital conjugado según la fórmula: donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un kit de ensayo, para determinar fenobarbital en una muestra, que contiene en un paquete combinado micropartículas recubiertas con un anticuerpo específico del fenobarbital, instrucciones para efectuar la determinación y un análogo de fenobarbital conjugado según la fórmula: donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un método de inmunoensayo, para determinar la presencia o la cantidad de fenobarbital en una muestra, que comprende las etapas de: combinar una muestra susceptible de contener fenobarbital con un anticuerpo específico del fenobarbital y con un análogo de fenobarbital conjugado - de modo que el anticuerpo está unido a micropartículas y el fenobarbital de la muestra compite con el análogo de fenobarbital conjugado para unirse al anticuerpo, y de modo que la unión del análogo de fenobarbital conjugado al anticuerpo fijado a las micropartículas inhibe la aglutinación de éstas y determinar el grado de inhibición de la aglutinación como medida de la presencia o de la cantidad de fenobarbital en la muestra, en el cual el análogo de fenobarbital conjugado tiene la estructura donde R es aminodextrano. , , , ,   Otra forma de ejecución de la presente invención es un método de inmunoensayo, para determinar la presencia o la cantidad de fenobarbital en una muestra, que comprende las etapas de: combinar una muestra susceptible de contener fenobarbital con un anticuerpo específico del fenobarbital y con un análogo de fenobarbital conjugado - de modo que el anticuerpo está unido a micropartículas y el fenobarbital de la muestra compite con el análogo de fenobarbital conjugado para unirse al anticuerpo, y de modo que la unión del análogo de fenobarbital conjugado al anticuerpo fijado a las micropartículas inhibe la aglutinación de éstas y determinar el grado de inhibición de la aglutinación como medida de la presencia o de la cantidad de fenobarbital en la muestra, en el cual el análogo de fenobarbital conjugado tiene la estructura donde R es aminodextrano. Otra forma de ejecución de la presente invención es un método de inmunoensayo, para determinar la presencia o la cantidad de fenobarbital en una muestra, que comprende las etapas de: combinar una... [Seguir leyendo]

donde n es 4-6, m es 1-4, R es -NHCO- o -CONH-, L es un grupo conector que lleva 2-18 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos dispuestos en una cadena lineal o ramificada y que contiene hasta 1 estructura cíclica, a condición de que el primer átomo unido a R sea de carbono, y Z es un grupo saliente o un polisacárido. 2. Un compuesto que posee una estructura donde n es 4-6, L es un grupo conector que lleva 2-18 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos dispuestos en una cadena lineal o ramificada y que contiene hasta 1 estructura cíclica, con la condición de que el primer átomo unido a -CONH- sea de carbono, y Z es un grupo saliente o un polisacárido. 3. Un análogo de fenobarbital según la reivindicación 1 que posee una estructura 4. Un análogo de fenobarbital según la reivindicación 2 que posee una estructura 5. Un análogo de fenobarbital según la reivindicación 1 que posee una estructura 16 , ,   6. Un análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 1 que posee una estructura donde R es aminodextrano. 7. Un análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 2 que posee una estructura donde R es aminodextrano. 8. Un análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 1 que posee una estructura donde R es aminodextrano. 9. Un kit de ensayo para determinar fenobarbital en una muestra, que contiene en un paquete combinado micropartículas recubiertas con un anticuerpo específico del fenobarbital, el análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 6 e instrucciones para efectuar la determinación. 10. Un kit de ensayo para determinar fenobarbital en una muestra, que contiene en un paquete combinado micropartículas recubiertas con un anticuerpo específico del fenobarbital, el análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 7 e instrucciones para efectuar la determinación. 11. Un kit de ensayo para determinar fenobarbital en una muestra, que contiene en un paquete combinado 17 , , ,   micropartículas recubiertas con un anticuerpo específico del fenobarbital, el análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 8 e instrucciones para efectuar la determinación. 12. Un método de inmunoensayo, para determinar la presencia o la cantidad de fenobarbital en una muestra, que comprende las etapas de: combinar una muestra susceptible de contener fenobarbital con un anticuerpo específico del fenobarbital y con un análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 6 - de modo que el anticuerpo está unido a micropartículas y el fenobarbital de la muestra compite con el análogo de fenobarbital conjugado para unirse al anticuerpo, y de modo que la unión del análogo de fenobarbital conjugado al anticuerpo fijado a las micropartículas inhibe la aglutinación de éstas y determinar el grado de inhibición de la aglutinación como medida de la presencia o de la cantidad de fenobarbital en la muestra 13. Un método de inmunoensayo, para determinar la presencia o la cantidad de fenobarbital en una muestra, que comprende las etapas de: combinar una muestra susceptible de contener fenobarbital con un anticuerpo específico del fenobarbital y con un análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 7 - de modo que el anticuerpo está unido a micropartículas y el fenobarbital de la muestra compite con el análogo de fenobarbital conjugado para unirse al anticuerpo, y de modo que la unión del análogo de fenobarbital conjugado al anticuerpo fijado a las micropartículas inhibe la aglutinación de éstas y determinar el grado de inhibición de la aglutinación como medida de la presencia o de la cantidad de fenobarbital en la muestra 14. Un método de inmunoensayo, para determinar la presencia o la cantidad de fenobarbital en una muestra, que comprende las etapas de: combinar una muestra susceptible de contener fenobarbital con un anticuerpo específico del fenobarbital y con un análogo de fenobarbital conjugado según la reivindicación 8 - de modo que el anticuerpo está unido a micropartículas y el fenobarbital de la muestra compite con el análogo de fenobarbital conjugado para unirse al anticuerpo, y de modo que la unión del análogo de fenobarbital conjugado al anticuerpo fijado a las micropartículas inhibe la aglutinación de éstas y determinar el grado de inhibición de la aglutinación como medida de la presencia o de la cantidad de fenobarbital en la muestra 18   Figura 1 purif. por HPLC prep. reflujo 19   Figura 2 reflujo reflujo producto secundario   Figura 3 21 purif. por HPLC prep. purif. por HPLC prep.   Figura 4 Ácido 4-(aminometil)-benzoico purif. por HPLC prep. 22   Figura 5 adición inversa 23 adición inversa purif. por HPLC prep.   Figura 6 adición inversa 24   Figura 7 Aminodextrano Aminodextrano Aminodextrano Aminodextrano Aminodextrano aminodextrano aminodextrano aminodextrano aminodextrano aminodextrano   Figura 8 Fenobarbital curvas estándar Fenobarbital ug/ml 26