Unión reversible de un polímero activo en la membrana a un polinucleótido.

Composición para el suministro de un oligonucleótido a una célula,

que comprende: un conjugado poliaminaactiva en la membrana - oligonucleótido, en el que la poliamina está unida al oligonucleótido por medio de un enlacecovalente sensible al pH o lábil a disulfuro y las aminas en la poliamina están modificadas reversiblemente medianteanhídridos maleicos disustituidos.

Unión reversible de un polímero activo en la membrana a un polinucleótido.

CAMPO DE LA INVENCIÓN.

Esta patente se refiere al suministro de polinucleótidos a células in vitro o células en mamíferos post-natales, 5 utilizando conjugados moleculares reversibles.

FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN.

La vía de entrada celular para la mayoría de los fármacos convencionales es la difusión a través de la membrana biológica. Por esta razón, los fármacos tienden a ser pequeños (MW < 500) y anfipáticos, conteniendo funcionalidades tanto hidrófobas como hidrófilas. Estas características dan lugar a moléculas con solubilidad en 10 agua, permitiéndolas al mismo tiempo cruzar la bicapa lipídica no polar de la membrana celular. En cambio, los fármacos utilizados en terapias antisentido y génicas son polímeros hidrófilos relativamente grandes y frecuentemente están también muy cargados negativamente. Ambas características físicas impiden su difusión directa a través de la membrana celular. Por esta razón, la principal barrera para la terapia génica y la terapia antisentido es el suministro del fármaco al interior de la célula. Esta situación contrasta con el desarrollo de fármacos

estándar, en el que la identificación del fármaco es la barrera principal en el desarrollo.

La transferencia de genes o polinucleótidos a las células es una importante técnica para la investigación biológica y médica, así como para aplicaciones potencialmente terapéuticas. El polinucleótido precisa ser transferido a través de la membrana celular y al interior de la célula. Los métodos de transferencia génica que se están estudiando actualmente incluyen vectores virales y los métodos no virales.

Los polímeros pueden facilitar la entrada celular de oligonucleótidos. Por ejemplo, se ha postulado que algunos polímeros, tales como la polietilenimina, interrumpen la función endosómica/lisosómica a través de un efecto de esponja de protones. La interrupción de la función endosómica/lisosómica se ha logrado también uniendo agentes endosómicos o de rotura de la membrana, tales como péptidos de fusión o adenovirus, en el policatión o complejo.

Los polímeros que son sensibles al pH han encontrado una amplia aplicación en el área del suministro de fármacos

a causa de su capacidad para explotar diferentes gradientes de pH fisiológicos e intracelulares para el propósito de la liberación controlada de fármacos. La sensibilidad al pH puede ser ampliamente definida como cualquier cambio en las propiedades físico-químicas de polímeros sobre un intervalo de pH. Definiciones más estrechas demandan cambios significativos en la capacidad del polímero para retener o liberar una sustancia bioactiva en un intervalo de pH tolerado fisiológicamente (típicamente pH 5, 5 - 8) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN.

La presente invención es lo siguiente:

1. Composición para el suministro de un oligonucleótido a una célula, que comprende: un conjugado de poliamina activa en la membrana - oligonucleótido, en el que la poliamina está unida al oligonucleótido por medio de un enlace covalente sensible al pH o lábil a disulfuro y las aminas en la poliamina están modificadas

reversiblemente mediante anhídridos maleicos disustituidos.

2. Composición según 1, en la que los anhídridos maleicos disustituidos son anhídridos dimetil maleicos sustituidos con carboxilato (CDM) .

3. Composición según 1 o 2, en la que la poliamina y el oligonucleótido están unidos covalentemente por medio de un tioéster de anhídrido dimetilmaleico sustituido con caboxilato (CDM) .

40 4. Composición según cualquiera de los apartados 1 a 3, en la que el oligonucleótido se elige entre el grupo que consiste en dsRNA, siRNA, microRNA, casete de expresión de siRNA, oligonucleótido antisentido y ribozima.

5. Composición según cualquiera de los apartados 1 a 4, en la que el oligonucleótido se modifica para contener un grupo reactivo en el término 3’ o 5’.

45 6. Composición según cualquiera de los apartados 1 a 5, en la que el oligonucleótido es un oligonucleótido modificado con amina o con cisteína.

7. Composición según 1, en la que dos o más oligonucleótidos están unidos covalentemente a la poliamina.

8. Composición según cualquiera de los apartados 1 a 7, en la que la poliamina se elige entre el grupo que consiste en poliamina anfipática, polivinil éter anfipático, y péptido activo en la membrana.

50 9. Composición según el apartado 8, en la que el péptido activo en la membrana comprende pardaxina.

10. Método in vitro para suministrar un polinucleótido a una célula, que comprende:

(a) formar un conjugado de poliamina activa en la membrana - polinucleótido en el que la poliamina está unida al polinucleótido por medio de un enlace covalente sensible al pH o lábil a disulfuro;

(b) modificar reversiblemente las aminas del polímero por reacción con anhídridos maleicos disustituidos, preferentemente anhídridos dimetilmaleicos sustituidos con carboxilato (CDM) ; y

(c) poner en contacto la célula con el conjugado.

11. Método según el apartado 10, en el que la poliamina y el oligonucleótido están unidos covalentemente por medio de un tioéster de anhídrido dimetilmaleico sustituido con carboxilato (CDM) .

12. Composición según cualquiera de los apartados 1 a 9 para el tratamiento mediante terapia génica o terapia antisentido.

Los autores de la presente invención describen conjugados de polímero activo en la membrana -polinucleótido covalentes escindibles, para el suministro de polinucleótidos a las células. El polinucleótido puede ser ADN, ARN, o polinucleótidos sintéticos u oligonucleótidos. La célula puede estar in vitro o in vivo. Un polímero preferido es un poliviniléter anfifílico. Un polímero de poliviniléter puede contener subunidades monómeras elegidas en la lista que comprende alquil vinil éteres, vinil éteres cargados positivamente, vinil éteres cargados negativamente, aril vinil éteres y vinil éteres que contienen polietilenglicol y sacárido. El enlace covalente escindible entre el polímero activo en la membrana y el polinucleótido puede ser reactivo en presencia de ácido o tioles. El polímero activo en la membrana puede favorecer la entrada de polinucleótido en una célula a través de la membrana plasmática o a través de la rotura de las membranas endocíticas.

Los autores de la presente invención describen agentes de transfección de polinucleótidos que comprenden: conjugados moleculares de polinucleótidos y polímeros activos en la membrana en los que el polímero activo en la membrana está unido al polinucleótido por medio de un enlace lábil o escindible. El polímero activo en la membrana puede ser elegido entre las listas que consisten en: polímero anfipático, poliviniléter anfipático, y péptido activo en la membrana. El enlace lábil o escindible puede ser elegido entre la lista que consiste en: enlaces lábiles al pH, maleamato, acetal, éter enólico y enlace disulfuro. El polinucleótido puede ser elegido entre la lista que consiste en: polinucleótido monocatenario, polinucleótido bicatenario, DNA, RNA, oligonucleótido, vector de expresión, siRNA, microRNA, ribozima, polinucleótido antisentido y polinucleótido sintético.

Los autores de la presente invención describen la modificación reversible de conjugados de polímero activo en la membrana - polinucleótido catiónicos para formar conjugados de polímero - polinucleótido aniónicos que comprenden: formar un conjugado de poliamina - polinucleótido y modificar las aminas en el polímero mediante reacción con anhídridos maleicos. La modificación de aminas en el polímero mediante reacción con anhídridos maleicos puede reducir la actividad de membrana del polímero. Una poliamina preferida es un polivinil éter. Un anhídrido maleico preferido es un anhídrido maleico disustituido. Un anhídrido maleico disustituido preferido es el anhídrido 2-propiónico-3-metilmaleico. La exposición al ácido de la poliamina modificada, tal como en un endosoma, tiene por resultado la escisión del anhídrido y la modificación... [Seguir leyendo]

1. Composición para el suministro de un oligonucleótido a una célula, que comprende: un conjugado poliamina activa en la membrana - oligonucleótido, en el que la poliamina está unida al oligonucleótido por medio de un enlace covalente sensible al pH o lábil a disulfuro y las aminas en la poliamina están modificadas reversiblemente mediante anhídridos maleicos disustituidos.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que los anhídridos maleicos disustituidos son anhídridos dimetil maleicos sustituidos con carboxilato (CDM) .

3. Composición según las reivindicaciones 1 o 2, en la que la poliamina y el oligonucleótido están unidos covalentemente por medio de un tioéster de anhídrido dimetilmaleico sustituido con caboxilato (CDM) .

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el oligonucleótido se elige entre el grupo que consiste en dsRNA, siRNA, microRNA, casete de expresión de siRNA, oligonucleótido antisentido y ribozima.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el oligonucleótido se modifica para contener un grupo reactivo en el término 3’ o 5’.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el oligonucleótido es un oligonucleótido modificado con amina o con cisteína.

7. Composición la reivindicación según 1, en la que dos o más oligonucleótidos están unidos covalentemente a la poliamina.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la poliamina se elige entre el grupo que consiste en poliamina anfipática, polivinil éter anfipático, y péptido activo en la membrana.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que el péptido activo en la membrana comprende pardaxina.

10. Método in vitro para suministrar un polinucleótido a una célula, que comprende:

(a) formar un conjugado de poliamina activa en la membrana - polinucleótido en el que la poliamina está unida al polinucleótido por medio de un enlace covalente sensible al pH o lábil a disulfuro;

(b) modificar reversiblemente las aminas del polímero por reacción con anhídridos maleicos disustituidos, preferentemente anhídridos dimetilmaleicos sustituidos con carboxilato (CDM) ; y

(c) poner en contacto la célula con el conjugado.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la poliamina y el oligonucleótido están unidos covalentemente por medio de un tioéster de anhídrido dimetilmaleico sustituido con carboxilato (CDM) .

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento mediante terapia génica o terapia antisentido.