Una composición acuosa estabilizada de alfa-galactosidasa y métodos relacionados con la misma.

Una composición acuosa que comprende una proteína bacteriana con actividad enzimática alfa-galactosidasa,

que se caracteriza en que dicha composición contiene arginina a una concentración por encima de 100 mM, enparticular a una concentración de al menos 150 mM, y en la que la conductividad de dicha composición es comomucho 40 mS/cm.

Una composición acuosa estabilizada de alfa-galactosidasa y métodos relacionados con la misma

La presente invención está relacionada con una composición acuosa que comprende una proteína con actividad enzimática de alfa-galactosidasa. La presente invención está relacionada además con un método para estabilizar una composición acuosa que comprende una proteína con actividad enzimática de alfa-galactosidasa, así como a un método para preparar una composición acuosa purificada que comprende dicha proteína con actividad enzimática de alfa-galactosidasa.

El sistema de grupos sanguíneos ABO, descubierto en 1900, juega un papel importante en la transfusión de sangre humana y, en consecuencia, en medicina transfusional. El sistema de grupos sanguíneos ABO está basado en la presencia o ausencia de los antígenos de grupos sanguíneos A y B, respectivamente. Las correspondientes estructuras de carbohidratos de grupos sanguíneos, designadas ABH, se encuentran en la superficie de los eritrocitos, en particular en el extremo de las cadenas de oligosacárido sobre glucoproteínas y glucolípidos. Esto es, el antígeno A que se encuentra en los eritrocitos del grupo sanguíneo A está especificado por una Nacetilgalactosamina a-1, 3-unida (GalNAc) terminal, mientras que el antígeno B del grupo sanguíneo B está especificado por un monosacárido de galactosa a-1, 3-unida (Gal) terminal como monosacárido inmunodominante.

Las enzimas activas sobre los carbohidratos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y han encontrado aplicaciones en muchos procesos biotecnológicos y farmacéuticos (Davies et al., 2005) . La eliminación enzimática de los antígenos de grupo sanguíneo ABO para desarrollar glóbulos rojos universales era una visión pionera originalmente propuesta hace más de 25 años. La eliminación enzimática de la N-acetilgalactosamina a-1 , 3unidos y monosacáridos de galactosa a-1, 3- unidos de células sanguíneas del grupo A y B, respectivamente, con lo que ofrece un enfoque atractivo para mejorar la seguridad de las transfusiones y el suministro de sangre total. Originalmente, se previó convertir enzimáticamente los antígenos A y B en los glóbulos rojos de la sangre en antígenos H, respectivamente, mediante el uso de exoglucosidasas para la eliminación selectiva de los residuos a-GalNAc Y a-Gal de los antígenos inmunodominantes del trisacárido A y B. Especialmente, las alfa-N-acetilgalactosaminidasas y las alfa-galactosidasas son de particular interés en la conversión enzimática de los glóbulos rojos de la sangre del grupo sanguíneo A, B y AB (WO 03/027245 A2) . Mientras que la exoglucosidasa alfa-N-acetilgalactosaminidasa (A-zima) hidroliza específicamente residuos de a-1 , 3-GalNAc terminal en los glóbulos rojos de la sangre del grupo A, la exoglucosidasa alfa-galactosidasa (B-zima) hidroliza específicamente residuos de a-1, 3galactosa terminal en los glóbulos rojos de la sangre del grupo B. Ambas reacciones enzimáticas dan origen a la formación de la estructura común H que se encuentra en los glóbulos rojos de la sangre de grupo 0.

Para la conversión de los glóbulos rojos del grupo B, se utilizó en primer lugar una alfa-galactosidasa derivada de granos de café verdes. Se demostró que la conversión enzimática de glóbulos rojos es plausible, y, además, que las células sanguíneas convertidas pueden funcionar en las transfusiones, la implementación clínica no fue posible debido a las grandes cantidades de enzima necesaria. Más recientemente, se describió la utilización de una alfagalactosidasa de la bacteria marina Pseudoalteromonas spec. para eliminar los residuos de galactosa alfa-1, 3-unida de eritrocitos del grupo sanguíneo B (Bakunina et al., 1998) . Además, se encontraron dos familias de genes bacterianos de glucosidasa que proporciona enzimas capaces de eliminar de forma eficiente los antígenos A y B a pH neutro con un bajo consumo de enzimas recombinantes (Liu et al., 2007) . Entre estas había un fragmento recombinante N-terminal de la alfa-galactosidasa derivada del organismo bacteriano Bacteroides fragilis.

La tecnología del ADN recombinante ha revolucionado la bioquímica, ya que nació en la década de 1970. Por un lado, debido a la sensibilidad de las técnicas microquímicas recientemente desarrolladas en combinación con la amplificación que ofrece la clonación de genes y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , las proteínas endógenas de células o tejidos de cualquier tipo así como sus ARN mensajeros correspondientes pueden así servir como punto de partida para la clonación y aislamiento de sus correspondientes genes. Por otro lado, la tecnología de ADN recombinante abrió el camino para la producción eficiente a gran escala de los genes así identificados y aislados, ya que permite la introducción de un ADN que codifica una proteína de interés en organismos huésped o en células que crecen en cultivo con el fin de expresar la proteína recombinante. En particular, se consideran las bacterias como huéspedes ideales tanto para la expresión de genes como para la amplificación génica ya que representan fábricas fáciles de manejar para la producción de una amplia gama de proteínas procariotas y eucariotas. La expresión de proteínas recombinantes heterólogas en una célula huésped bacteriana, sin embargo, a menudo resulta en la formación de cuerpos de inclusión que contienen la proteína de interés en forma agregada e insoluble, con la consecuencia de que la proteína expresada no es accesible para una purificación bioquímica adicional. En este caso, la recuperación de proteínas recombinantes requiere la solubilización de cuerpos de inclusión y el replegamiento de las proteínas en su estructura activa.

Las enzimas alfa-galactosidasa, que están clasificadas como EC 3.2.1.22 por la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica, se expresan de forma endógena por una serie de microorganismos, plantas y animales. No obstante, la provisión de composiciones acuosas de enzima in vitro, es muy difícil debido al rápido descenso de la actividad alfa-galactosidasa cuando se almacena en una solución acuosa. En particular, es un problema general en la técnica que las alfa-galactosidasas expresadas recombinantemente formen precipitados insolubles en ausencia de sal, es decir en tampones con baja conductividad. Esta precipitación ocurre rápidamente, resulta ser irreversible, y se ve favorecida en el contexto de concentraciones altas de proteína. Los métodos de purificación de alfa-galactosidasa conocidos a bajas concentraciones de proteína (para evitar la precipitación) , no obstante, no son una opción adecuada para un proceso de producción económicamente útil. Hasta ahora, la precipitación de la enzima por lo general ha sido impedido por la adición de sal en una concentración adecuada. Por lo tanto, un tampón que contiene alta concentración de sal es indispensable para la estabilización de la enzima en solución. Por ejemplo, un tampón que se utiliza comúnmente para el almacenamiento de enzima alfa-galactosidasa consta de fosfato de sodio 25 mM y NaCl 0, 3 M, pH 7, 0. No obstante, estas condiciones de tampón de salinidad alta, no permiten algunos de los métodos de purificación bioquímicos que podrían ser deseables tales como, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico que requiere la unión de la proteína a una columna en condiciones bajas de sal. La cromatografía de intercambio catiónico representa una herramienta esencial para lograr una composición de alfa-galactosidasa sustancialmente pura, ya que es el método más favorable para la eficiente eliminación de productos de degradación y / u otras proteínas contaminantes.

Alternativamente, la proteína de interés puede purificarse mediante la cromatografía de intercambio aniónico. Es decir, las proteínas con un punto isoeléctrico en el intervalo de pH ácido pueden unirse a resinas de intercambio aniónico a valores de pH alcalinos. La alfa-galactosidasa, no obstante, en particular la alfa-galactosidasa de Bacteriodes fragilis como se ha descrito por Liu et al. (2007) tiene un punto isoeléctrico de pI 6, 72, es soluble pero inestable en tampones con valores de pH alcalinos (por ejemplo a aproximadamente pH

; 9, 0 o superior) . La incubación de la enzima en tampones con un pH alcalino por lo tanto conduce a una pérdida irreversible de la actividad de la enzima. Por consiguiente, la purificación de la proteína por medio de cromatografía de intercambio aniónico a valores de pH de aproximadamente pH ; 9, 0 noparece ser una opción para una estrategia de purificación de alfa-galactosidasa (también designado "B-zima" en el contexto de la presente invención) .

Por lo tanto, es un objeto de la presente... [Seguir leyendo]

1. Una composición acuosa que comprende una proteína bacteriana con actividad enzimática alfa-galactosidasa, que se caracteriza en que dicha composición contiene arginina a una concentración por encima de 100 mM, en particular a una concentración de al menos 150 mM, y en la que la conductividad de dicha composición es como mucho 40 mS/cm.

2. La composición de la reivindicación 1, que se caracteriza en que dicha composición contiene arginina a una concentración entre 150 mM y 2 M, más preferiblemente entre 200 y 400 mM, lo más preferible entre 250 mM y 320 mM.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, que se caracteriza además en que la conductividad de dicha composición está entre 15 mS/cm y 25 mS/cm, más preferiblemente entre 18 mS/cm y 22 mS/cm.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza en que el pH de dicha composición está entre pH 5 y pH 7.5, preferiblemente entre pH 5, 5 y pH 7, más preferiblemente entre pH 5, 8 y pH 6, 5.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza en que dicha composición deriva de una célula huésped bacteriana, preferiblemente de E. coli.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza además en que el contenido total de proteína de dicha composición es de al menos 20 mg/ml.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza además en que la actividad enzimática de alfa-galactosidasa está entre 0, 5 y 0, 8 unidades/mg de proteína total.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se caracteriza en que dicha proteína posee una especificidad de sustrato de EC 3.2.1.22, preferiblemente en el que dicha proteína hidroliza porciones terminales de alfa-1, 3-galactosilo.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza en que dicha proteína con actividad enzimática e alfa-galactosidasa es un derivado o fragmento funcionalmente activo de una proteína natural.

10. La composición de la reivindicación 9, que se caracteriza en que dicha proteína deriva del organismo bacteriano Bacteroides fragilis, preferiblemente en la que dicha proteína es un fragmento de la alfa-galactosidasa de Bacteroides fragiles que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 1, o cualquier derivado o fragmento funcionalmente activo de la misma.

11. Un método para estabilizar una composición acuosa que comprende una proteína bacteriana con actividad enzimática de alfa-galactosidasa, que se caracteriza en que dicho método comprende el paso de añadir arginina a dicha composición a una concentración final por encima de 100 mM, en particular de al menos 150 mM, y en que la conductividad de dicha composición es como mucho 40 mS/cm.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha composición se caracteriza además como en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

13. Un método para preparar una composición acuosa purificada que comprende una proteína bacteriana con actividad enzimática alfa-galactosidasa, dicho método comprende los pasos de

(a) proporcionar una composición que contiene dicha proteína con actividad enzimática alfa-galactosidasa,

(b) concentrar la composición del paso (a) en presencia de arginina a una concentración por encima de 100 mM, en particular de al menos 150 mM, en la que la composición posee una conductividad de como mucho 40 mS/cm, y

(c) purificar la composición del paso (b) mediante cromatografía de intercambio de cationes.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha composición del paso (b) se caracteriza además como en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, que se caracteriza además en que dicho método comprende uno o más pasos de purificación adicionales (i) antes y/o después del paso (b) , y/o (ii) antes y/o después del paso (c) .