Un kit para detectar un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana empleado para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por fármacos,

en el que el kit comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de 10 a 35 bases como se define a continuación en (a) a (f) como cebadores o sondas para detectar polimorfismos del gen del sustrato 2 del receptor de insulina:

(a) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de C en A en la posición 4.587 en 5' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(b) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es deleción de AT en la posición 2.510 en 5' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(c) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de A en C en la posición 1.164 en 5' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(d) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de A en C en la posición 15.870 en 3' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(e) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es la conversión de A en C en la posición 29.793 en 3' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; y

(f) un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genético que es deleción de C en la posición 31.532 en 3' del codón de inicio de la traducción del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana. en el que los números de posición corresponden a los números de posición contando desde A de ATG como codón para Met al extremo N de la proteína cuando se traduce el ARNm en la proteína.

Un kit para juzgar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos.

Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere a un procedimiento para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos mediante el uso, como indice, de un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana; a un procedimiento de detectar el polimorfismo genetico empleado como indice de la evaluacion del riesgo mencionada anteriormente; a oligonucleotidos empleados para estos procedimientos; y a un kit para la evaluacion y/o la deteccion.

Tecnica anterior

El pilar principal de la medicina moderna es la terapia farmacologica, que emplea farmacos para tratar o prevenir diversas enfermedades. Casi todos los farmacos empleados en la terapia farmacologica (p. ej., compuestos de bajo peso molecular) son, intrinsecamente, sustancias extranas para el cuerpo humano y, por tanto, la administracion de dichos farmacos proporciona eficacia terapeutica pero puede producir diversos efectos secundarios. Dichos efectos secundarios a menudo hacen que se abandone la terapia farmacologica. Asimismo, algunos farmacos se han encontrado una situacion en la que la investigacion y el desarrollo se tienen que suspender debido a efectos secundarios graves, aunque se ha demostrado que los farmacos son utiles para pacientes con una enfermedad determinada. Ademas, el uso de algun otro farmaco esta estrictamente regulado con el fin de detectar el signo de sus efectos secundarios mediante exploraciones obligatorias.

De acuerdo con las estadisticas publicadas en EE.UU., los casos de efectos secundarios inducidos por farmacos constituyen dos millones o mas al ano y mas de 100.000 debido a dichos efectos secundarios (JAMA, 279, 1200 (1998) ) . En Japon, se han notificado 26.545 de efectos secundarios inducidos por farmacos (incluidos casos notificados de forma redundante) y 1.239 muertes por dichos efectos secundarios solo en el ano 2000 (Ministr y of Health, Labor and Welfare, June 6, 2003, House of Representatives, Responsive Pleading No. 55) .

Entre los efectos secundarios debidos a la administracion de farmacos, la granulocitopenia es un efecto secundario mortal. En particular, una disminucion en los granulocitos tiende a producir una infeccion y el inicio de agranulocitosis implica un riesgo muy alto de enfermedad infecciosa grave, tal como neumonia o sepsis. Ejemplos de farmacos que en general se sabe que inducen granulocitopenia incluyen farmacos analgesicos-antipireticos (aminopirina) , antibioticos (cloromicetina) , farmacos antitiroideos (merazol) , farmacos anticonvulsivos, farmacos antidiabeticos y farmacos diureticos. Es menos probable que la aparicion de efectos secundarios causados por dicho farmaco este relacionada con su dosis y se considera que esta relacionada con la predisposicion de un paciente (p. ej., predisposicion alergica o idiosincrasia) . Por tanto, la aparicion de dichos efectos secundarios es casi imposible de predecir. Con el fin de evitar la aparicion de dichos efectos secundarios, los medicos deben manejar sus respectivos casos cuidadosamente, mediante entrevistas detalladas con pacientes individuales con respecto a, por ejemplo, los registros de administracion de farmacos en otros departamentos, un analisis de los resultados de analisis de sangre etc. Es notable el hecho de que si y cuando un paciente presenta un inicio de un efecto secundario de granulocitopenia, los medicos deberan tomar medidas inmediatas, incluida la hospitalizacion.

Se conocen otros farmacos que inducen granulocitopenia, entre los que se incluye dibenzodiazepina (clozapina) , que es un farmaco antipsicotico. Cabe esperar que este farmaco tenga una eficacia alta, pero los ensayos clinicos del farmaco en Japon se han suspendido. Otros farmacos que inducen granulocitopenia incluyen vesnarinona, que tiene actividades inhibidoras sobre PDE3 y los canales de K. Este farmaco es un farmaco inotropico eficaz que es menos probable que produzca arritmias y otros acontecimientos cardiacos (p. ej., inicio de insuficiencia cardiaca y hospitalizacion) . No obstante, la administracion de este farmaco puede producir efectos secundarios, por ejemplo leucopenia, granulocitopenia y la posterior agranulocitosis. Por tanto, el uso de este farmaco esta estrictamente limitado.

Los polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) son los marcadores geneticos mas usados en los analisis geneticos humanos. Ya se ha demostrado que los SNP son marcadores utiles para un estudio de asociacion entre los antecedentes geneticos y las enfermedades habituales o respuestas farmacologicas (veanse los documentos no patentes 1, 2 y 3) . Como se sabe, el analisis del haplotipo, construido con multiples SNP, es util para analizar la susceptibilidad de enfermedades poligenicas (veanse los documentos no patentes 4 y 5) . En la practica, algunas enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer y la hipertension, ya han sido analizados intensamente mediante dicho procedimiento de analisis (Jeunemaitre, X., y col., Am. J. Hum. Genet., 60, 1448-1460 (1997) ; Martin, E. R., Am. J. Hum. Genet., 67, 383-394 (2000) ) .

En los ultimos anos, los avances en el analisis del genoma han conducido al desarrollo de la toxicogenomica, que estudia la relacion entre genes y toxicidades, tales como el efecto de un farmaco sobre el citocromo P450 (CYP) (es decir, una enzima de metabolismo de farmacos) . En concreto, los estudios de asociacion de antecedentes geneticos individuales y la sensibilidad/respuesta se han propuesto como una herramienta potente para acarar la causa de los efectos adversos. Cabe esperar que la denominada terapia adaptada se realice a traves de estos enfoques.

Documento no patente 1: Brookes, A. J., "The essence of SNPs, " Gene, USA, (1999) , 234, 177-186

Documento no patente 2: Cargill, M, y col., "Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes, " Nature Genet., USA, (1999) , 22, 231-238

Documento no patente 3: Evans, W. E., & Reiling, M. V., "Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics, " Science, USA, (1999) , 286, 487-491

Documento no patente 4: Stephens, J. C., et al., "Dating the origin of the CCRS-Delta32 AlDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes, " Am. J. Hum. Genet., USA, (1998) , 62, 1507-1515

Documento no patente 5: Tishkoff, S. A., y col., "The accuracy of statistical methods for estimation of haplotype frequencies: an example from the CD4 locus, " Am. J. Hum. Genet., USA, (2000) , 67, 518-522

Divulgacion de la invencion

Problemas que ha de resolver la invencion

Un objetivo principal de la presente invencion es proporcionar medios para evaluar el riesgo de garnulocitopenia inducida por farmacos mediante el uso, como indice, de polimorfismos del gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana o medios para detectar los polimorfismos geneticos empleados como indice para el medio de evaluacion del riesgo. Medios para resolver los problemas

Con el fin de resolver los problemas mencionados anteriormente, en primer lugar, los presentes inventores han seleccionado, como genes para el analisis de los polimorfismos, 115 genes candidatos, incluidos los genes relacionados con las citocinas, genes de la region del MHC, genes relacionados con G-CSF, genes relacionados con el TNF-, genes relacionados con NF , genes relacionados con AMPc y genes relacionados con los canales de K, en los que se buscaron SNP en estos genes candidatos de la base de datos de polimorfismos de un solo nucleotido japoneses y se escogieron 188 SNP candidatos para analisis.

Posteriormente, los presentes inventores han determinado la frecuencia de esos SNP en el ADN genomico de las muestras de los siguientes dos grupos: un grupo de sujetos con granulocitopenia inducida por la administracion de un farmaco especifico y un grupo de sujetos sin granulocitopenia que han recibido el mismo farmaco. Como resultado, los presentes inventores han confirmado que los SNP con la diferencia mas estadisticamente significativa entre los dos grupos mencionados anteriormente estan presentes en el gen del sustrato 2 del receptor de insulina (J-SNP 10: lMS-JST040476) (en lo sucesivo se hara referencia al gen como "gen lRS-2") .

Ademas, los presentes inventores han realizado amplios estudios sobre la relacion entre los polimorfismos en el gen lRS-2 humano y la granulocitopenia inducida por farmacos, y, como resultado, han confirmado que seis SNP del gen de lRS-2 humano estan estrechamente relacionados con la granulocitopenia inducida... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIONES

1. Un kit para detectar un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana empleado para determinar la presencia del riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, en el que el kit comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia de 10 a 35 bases como se define a continuacion en (a) a (f) como cebadores o sondas para detectar polimorfismos del gen del sustrato 2 del receptor de insulina:

(a) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(b) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(c) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(d) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(e) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; y

(f) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana.

en el que los numeros de posicion corresponden a los numeros de posicion contando desde A de ATG como codon para Met al extremo N de la proteina cuando se traduce el ARNm en la proteina.

2. Un kit para evaluar el riesgo de granulocitopenia inducida por farmacos, en el que el kit comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia de 10 a 35 bases como se define mas adelante en (a) a (f) que sirve como cebador o sonda para detectar un polimorfismo del gen del sustrato 2 del receptor de la insulina:

(a) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de C en A en la posicion 4.587 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(b) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de AT en la posicion 2.510 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(c) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 1.164 en 5' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(d) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 15.870 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana;

(e) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es la conversion de A en C en la posicion 29.793 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana; y

(f) un oligonucleotido que tiene una secuencia que incluye un polimorfismo genetico que es delecion de C en la posicion 31.532 en 3' del codon de inicio de la traduccion del gen del sustrato 2 del receptor de insulina humana.

en el que los numeros de posicion corresponden a los numeros de posicion contando desde A de ATG como codon para Met al extremo N de la proteina cuando se traduce el ARNm en la proteina.

3. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que ademas comprende un oligonucleotido que puede hibridar con el gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana y que se usa como sonda para la deteccion de polimorfismos geneticos, seleccionandose dicho oligonucleotido del grupo constituido por los oligonucleotidos descritos en (a) a (d) y (f) :

(a) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 3;

(b) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 6;

(c) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 9;

(d) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 12; y

(f) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 17;

4. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ademas comprende oligonucleotidos que pueden hibridar con el gen del sustrato 2 del receptor de la insulina humana y que se usan como cebadores para la deteccion de polimorfismos geneticos, seleccionandose dichos oligonucleotidos del grupo constituido por combinaciones de los oligonucleotidos descritos mas adelante en (a) y (b) , (c) y (d) , (e) y (f) , (g) y (h) , (i) y (j) , y (k) y (l) :

(a) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 1;

(b) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 2;

(c) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 4;

(d) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 5;

(e) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 7;

(f) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 8;

(g) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 10;

(h) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 11;

(i) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 13;

(j) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 14;

(k) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 15; y

(l) un oligonucleotido que tiene la secuencia de SEC lD N° 16

5. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en que dicho kit comprende oligonucleotidos como se describe en (e) de la reivindicacion 1 o 2 y la enzima de restriccion Afa l, usandose el kit para detectar la conversion de A en G en la posicion 29.793 en 3' desde el codon de inicio de la traduccion del sustrato 2 del receptor de la insulina humana.