Un método para detectar polisacáridos en una muestra biológica,

método que comprende someter la muestra atinción con Ácido Peryódico-Schiff seguido por detección de la luz emitida en el campo infrarrojo.

Tinción con ácido per y ódico-Schiff y detección en el campo infrarrojo.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un nuevo método para cuantificar glucógeno y otros polisacáridos en muestras 5 biológicas utilizando una reacción fluorescente con ácido per y ódico-Schiff (PAS) con detección en el campo infrarrojo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los polisacáridos son carbohidratos complejos que comprenden polímeros constituidos por muchos monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos. Los polisacáridos incluyen polisacáridos de reserva tales como almidones y 10 glucógeno, y polisacáridos estructurales tales como celulosa, polisacáridos que contienen ácido siálico o grupos de ésteres sulfúricos, y quitina. Los polisacáridos tienen diversas funciones biológicas que incluyen almacenamiento de azúcares a largo plazo (para energía) , y soporte estructural y protección a los organismos; la celulosa es un componente principal de las paredes celulares en plantas y bacterias, y la quitina es un componente de las paredes celulares de los hongos y los exoesqueletos de los artrópodos. Los polisacáridos están implicados también en el reconocimiento molecular (antígenos) por las células del sistema inmunitario.

El glucógeno es un polisacárido de reserva constituido por glucosa. La mayoría de las unidades de glucosa están unidas por enlaces glicosídicos α-1, 4, pero aproximadamente 1 de cada 12 residuos de glucosa forma también un enlace α-1, 6-glicosídico con una segunda glucosa, lo cual da como resultado la creación de una ramificación. El glucógeno está presente en una gran diversidad de tejidos, que incluyen piel, hígado, glándulas paratiroideas y la 20 musculatura esquelética y cardiaca. La detección del glucógeno se utiliza en situaciones clínicas para la diagnosis de enfermedades que incluyen cáncer, infecciones (hongos, Chlamydia) , diabetes (Tipo 1) , miopatías, enfermedad de almacenamiento de glucógeno (enfermedad de Pompe) , y otras glucogenosis. La detección histoquímica del glucógeno se utiliza también para identificar estructuras tales como tejidos conectivos, moco y láminas basales, sustancias corporales amiláceas, cuerpos de poliglucosano y otras sustancias en muestras biológicas, todos los cuales contienen una proporción elevada de macromoléculas de carbohidratos (glucógeno, glucoproteína, proteoglucanos) . Específicamente, PAS se utiliza para teñir mucopolisacáridos neutros, tales como los que se encuentran en las glándulas del tracto gastrointestinal y en la próstata; polisacáridos ácidos simples que contienen ácido siálico, tales como los encontrados en las células epiteliales; y polisacáridos ácidos sulfatados complejos tales como los encontrados en los adenocarcinomas.

Históricamente, la obtención de imágenes del contenido de polisacáridos, v.g., glucógeno, en células y tejidos se ha medido cualitativamente utilizando la reacción ácido per y ódico-Schiff (PAS) . PAS tiñe el glucógeno y otras moléculas de polisacáridos basándose en la escisión oxidante inducida por el ácido per y ódico de los enlaces carbono-carbono en los glicoles 1, 2 para formar dialdehídos que reaccionan con fuchsina-ácido sulfuroso en el reactivo de Schiff (pararrosanilina y metabisulfato de sodio) para producir un tinte semejante a magenta (Bancroft y Stevens, Theor y and practice of histological techniques. Churchill Livingstone, Edinburgo, p. 436-1977) . Más recientemente, la técnica PAS se ha combinado con medidas de la densidad óptica, y se ha comparado con las densidades ópticas de estándares externos con concentraciones conocidas de glucógeno, para conversión en valores cuantitativos de glucógeno (Schaart et al., Histochem Cell Biol. 2004; 122:161-169) .

Se ha descrito un método para la tinción de los glóbulos de la sangre con ácido per y ódico/saliciloil-hidracina (PA-SH)

(Burns et al., Blood. 1966; 28:674-682) . El método es el de Stoward en el cual soluciones acidificadas de saliciloilhidracina se conjugan con los dialdehídos formados por la oxidación con ácido per y ódico de glicoles vecinales en glucógeno. Se decía que los sitios reactivos emiten fluorescencia de un color azul intenso por exposición a la luz ultravioleta.

La medida de la intensidad de fluorescencia es otro enfoque utilizado comúnmente para cuantificar cantidades relati

45 vas o absolutas de materiales biológicos seleccionados. La fluorescencia se produce cuando una molécula en un estado excitado (es decir, excitado por absorción de radiación EM) emite luz a medida que cae al estado energético inferior. La emisión tiene lugar típicamente a una longitud de onda más larga que la longitud de onda de la radiación excitante absorbida, y se encuentra en el campo visible del espectro electromagnético. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia es directa, puede conseguirse fácilmente con instrumentos que van desde lectores de placas 50 de microtitulación, escáneres de fluorescencia, y microscopios de fluorescencia y confocales. El formato del lector de placas de microtitulación o de escáner de fluorescencia es particularmente adecuado para cuantificación y comparación simultáneas de un gran número de muestras, tal como es necesario en aplicaciones de alta capacidad.

La fluorescencia en el infrarrojo próximo es una técnica útil para obtención de imágenes in vivo, v.g., para detección de tumores. Este método está basado en el hecho de que el tejido vivo transmite fluorescencia con longitudes de 55 onda en el IR próximo (aproximadamente 700 nm) más eficientemente que el mismo transmite luz con longitudes de onda en el campo visible, debido a penetración incrementada de fotones. Agentes de contraste de fluorescencia tanto orgánicos como inorgánicos están disponibles actualmente para conjugación química a moléculas diana para obtención de imágenes. Sin embargo, esta técnica es para detección y obtención de imágenes in vivo y no se ha empleado para cuantificar material ex vivo en muestras biológicas.

La autofluorescencia de la tinción PAS en el campo visible rojo (excitación ~ 540-580 nm; emisión ~ 600-640 nm) ha sido descrita (Changaris et al., Histochemistr y , 1977; 52:1-15; Schaart et al., supra) y se ha utilizado para medida cuantitativa de glucógeno en secciones de hígado (Changaris et al., supra) . Aunque son útiles, las medidas de fluorescencia en el campo visible están sometidas a un alto ruido debido a la autofluorescencia de los materiales biológicos en el campo visible, y detección deficiente de la penetración de la señal a partir de secciones de tejido gruesas.

Una estrategia utilizada para resolver las limitaciones de las medidas de fluorescencia en el campo visible es la microscopía de obtención de imágenes por fluorescencia (Brenner et al., J Histochem Cytochem. 1976, 24:100-11) . Este método requiere el ensamblaje y la integración de equipo complejo que incluye una fuente de luz y filtros apropiados para excitación, un microscopio con óptica sensible, foco fino, un control de platina XY para la obtención de imágenes resueltas espacialmente, filtros de emisión, una cámara sensible para captura de las imágenes, y una computadora para control del microscopio, equipada con recogida de imágenes y software de procesamiento para documentación. El enfoque, el posicionamiento XY, la configuración del filtro, la captura y la recogida de imágenes se llevan a cabo independientemente para cada muestra y cada fluoróforo. Se utiliza software de procesamiento de las imágenes para combinar las dos imágenes de cada fluoróforo de una muestra dada a fin de observar la localización espacial de los dos fluoróforos simultáneamente. Esta imagen combinada final es una imagen cualitativa de la distribución espacial de las muestras de fluoróforo. Se utiliza software adicional de cuantificación de imágenes, que está diseñado para seleccionar una región de interés y cuantificar la intensidad de fluorescencia dentro de dicha región para cada fluoróforo, a fin de cuantificar la fluorescencia. Así, la fluorescencia se mide dentro de áreas de células o tejidos de interés, y en una región definida como ruido. Cada medida de fluorescencia se corrige por el tamaño de la región y se sustrae luego el ruido. La resolución espacial y focal exquisita que se consigue con esta metodología permite una detección suficiente de señal a ruido en el campo visible. Sin embargo, este método es tedioso dado que las muestras se convierten en imágenes de una en una, y las imágenes capturadas se procesan y cuantifican... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar polisacáridos en una muestra biológica, método que comprende someter la muestra atinción con Ácido Per y ódico-Schiff seguido por detección de la luz emitida en el campo infrarrojo.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual la detección tiene lugar a una longitud de onda en el intervalo de 5 aproximadamente 700 nM a 800 nM.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual el polisacárido es glucógeno.

4. El método de la reivindicación 1, en el cual la muestra biológica se deriva de un individuo humano sospechoso de padecer una enfermedad de almacenamiento de glucógeno.

5. El método de la reivindicación 4, en el cual la enfermedad de almacenamiento de glucógeno se selecciona del grupo constituido por enfermedad de Pompe; enfermedad de Cori's-Forbes; enfermedad de Andersen; enfermedad de Tauri; enfermedad de McArdle; deficiencia de fosforilasa b-quinasa (glucogenosis tipo VIII) ; Deficiencia de Ramificación del Glucógeno de los Equinos; deficiencia de isoforma A de la fosfoglicerato-quinasa (glucogenosis IX) ; deficiencia de fosfoglicerato-mutasa M (glucogenosis tipo X) ; deficiencia de triosafosfato-isomerasa (TIM) ; glucogenosis pulmonar intersticial; nefropatía diabética; y enfermedad de Lafora (epilepsia mioclónica) .

6. El método de la reivindicación 5, en el cual la enfermedad de almacenamiento de glucógeno es enfermedad de Pompe.

7. El método de la reivindicación 6, en el cual la enfermedad de almacenamiento de glucógeno es enfermedad de Pompe de aparición en la infancia.

8. El método de la reivindicación 7, en el cual la muestra biológica son células aisladas o tejido seleccionado del 20 grupo constituido por músculo hepático, de riñón, cardiaco, de cerebro y esquelético.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente cuantificar el nivel de polisacáridos presentes en la muestra biológica por comparación de la cantidad de luz emitida con la emitida por estándares de cantidades conocidas de polisacáridos.

10. Un método de detección de glucógeno en una muestra biológica de un individuo que padece o se sospecha padece enfermedad de Pompe, método que comprende someter la muestra a tinción con Ácido Per y ódico-Schiff seguido por detección de la luz emitida en el campo infrarrojo.

11. El método de la reivindicación 10, en el cual la detección se realiza a una longitud de onda comprendida en un intervalo de aproximadamente 700 nM a 800 nM.

12. El método de la reivindicación 10, en el cual la muestra biológica son células aisladas o tejido seleccionado del 30 grupo constituido por hígado, riñón, corazón, cerebro y músculo esquelético.

13. El método de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente cuantificar el nivel de polisacáridos presentes en la muestra biológica por comparación de la cantidad de luz emitida con la emitida por estándares de cantidades conocidas de glucógeno.

14. Un método de monitorización de la eficacia del tratamiento de un individuo que se trata por una enfermedad de 35 almacenamiento de glucógeno, método que comprende:

i) detectar glucógeno en una primera muestra biológica derivada del individuo antes de la iniciación del tratamiento de acuerdo con el método de la reivindicación 1;

ii) detectar glucógeno en una segunda muestra biológica derivada del individuo subsiguientemente a la iniciación del tratamiento de acuerdo con el método de la reivindicación 1;

iii) cuantificar los niveles de glucógeno en las dos muestras; y iv) comparar el nivel de glucógeno en la primera muestra con el nivel de glucógeno en la segunda muestra, en el cual una reducción en el nivel de glucógeno en la segunda muestra indica que el tratamiento es eficaz.

15. El método de la reivindicación 14, en el cual la enfermedad de almacenamiento de glucógeno es la enfermedad de Pompe.

Figura 3