SOPORTES HETEROFUNCIONALES ACTIVADOS Y SU USO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE PROTEÍNAS.
Soportes heterofuncionales activados y su uso para la inmovilización de proteínas.
La presente invención se refiere a soportes heterofuncionales activados con grupos capaces de adsorber proteínas a pH neutro vía diferentes mecanismos y grupos aldehído muy reactivos capaces de inmovilizar las enzimas previamente adsorbidas de modo covalente multipuntual. El uso de este tipo de soportes permite la inmovilización y rigidificación de enzimas a través de diferentes regiones de su superficie. Mediante la inmovilización de diferentes proteínas de interés industrial sobre diferentes soportes glioxil heterofuncionales se obtuvieron derivados con diferentes actividades, estabilidades y selectividades.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030392.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: GUISAN SEIJAS,JOSE MANUEL, MATEO GONZALEZ,CESAR, FERNANDEZ LORENTE,GLORIA, BOLIVAR BOLIVAR,JUAN MANUEL, PESSELA JOAO,Benevides.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K17/14 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 17/00 Péptidos fijados sobre un soporte o inmovilizados; Su preparación. › Péptidos inmovilizados sobre, o en, un soporte inorgánico.
- C12N11/14 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 11/00 Enzimas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Células microbianas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Su preparación. › Enzimas o células microbianas inmovilizadas sobre o en un soporte inorgánico.
- G01N33/68 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
PDF original: ES-2374236_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Soportes heterofuncionales activados y su uso para la inmovilización de proteínas.
Estado de la técnica anterior
La mayor aplicación de la inmovilización de enzimas a nivel industrial es la posibilidad de rehusar las enzimas durante numerosos ciclos de reacción (Cao L. Immobilised enzymes: science or art? Curr Opin Chem Biol. 2005; 9:217-26). Además para que esto sea rentable a nivel industrial estos procesos de inmovilización deberían ir unidos al incremento de la estabilidad de los derivados inmovilizados obtenidos. El desarrollo de nuevos protocolos de inmovilización y estabilización de enzimas que sean muy sencillos es uno de los logros más excitantes dentro del campo de la biotecnología. La inmovilización de enzimas por unión covalente multipuntual es una de las técnicas más interesantes para inmovilizar y estabilizar enzimas. Mediante la inmovilización utilizando estos métodos se han obtenido en el pasado preparaciones inmovilizadas con grandes factores de estabilización (entre 100-1000000 tal como han sido descritos) (Mateo, C.; Palomo, J.M.; Fernández-Lorente, G.; Guisan, J.M.; Fernández-Lafuente, R. (2007). Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques'' Enzyme Microb. Technol. 40, 1451-63). Teóricamente una molécula de enzima unida a un soporte rígido a través de muchos puntos, vía brazos espaciadores cortos, debe ser altamente estabilizada debido a que los residuos de aminoácido involucrados en estos procesos de inmovilización deben guardar inalteradas sus posiciones relativas durante los cambios conformacionales inducidos por diferentes agentes inactivantes (calor, disolventes, etc). De este modo los cambios conformacionales deben de ser muy atenuados (Pedroche et al. Effect of the support and experimental conditions in the intensity of the multipoint covalent attachment of proteins on glyoxyl-agarose supports. Correlation between enzyme-support linkages and thermal stability. Enzyme Microb. Technol. 40, 1160-1166; 2007).
Para conseguir este tipo de inmovilizaciones los soportes glioxil podrían ser muy adecuados debido a que tienen muy alta reactividad con grupos aminos no ionizados de las proteínas, presentan muy bajos impedimentos estéricos en la reacción de los grupos amino de la proteína con los glioxil del soporte, los grupos glioxil son muy estables lo que permite tiempos de contacto enzima-soporte así como almacenamientos prolongados de los mismos y además la reducción final de las iminas formadas utilizando borohidruro de sodio produce aminos secundarios muy estables y los grupos aldehído remanentes son transformados en grupos hidroxilo inertes.
Sin embargo, los soportes glioxil en general no son capaces de inmovilizar proteínas a pH neutro debido a que el equilibrio de la reacción de formación de un solo enlace imina (bases de Schiff) entre la enzima y el soporte estaría desplazado hacia la forma disociada de la misma. La única excepción a esto es el caso de proteínas multiméricas que tengan expuestos en el mismo plano varios grupos amino con un pK bajo (aminos terminales) que a pH neutro estarían desprotonados y por tanto se podrían formar varias bases de Schiff simultáneamente. Este hecho que podría parecer aparentemente un problema, convierte a estos soportes en muy adecuados para inmovilizar enzimas a pH 10 debido a que la inmovilización debe ser producida simultáneamente a través de varios grupos amino de la enzima con lo que la enzima se inmoviliza a través de la zona más rica en lisinas produciéndose en general derivados inmovilizados muy estabilizados respecto a la enzima soluble (Grazu V, Betancor L, Montes T, López-Gallego F, Guisan JM, Fernández-Lafuente R. Glyoxyl agarose as a new chromatographic matrix. Enzyme Microb Technol 2006; 38:960-6).
Sin embargo, sería deseable tener soportes donde la unión pueda venir producida no sólo por la región de la proteína donde se puedan formar más enlaces (p.e. la región más rica en lisinas) sino por otras regiones que pudieran ser mucho más sensibles a agentes inactivantes u otras que fueran muy interesantes como aquellas cercanas al centro activo.
Por otro lado la inmovilización de enzimas sobre soportes glioxil implica en general la necesidad de incubar la enzima soluble con el soporte a pH alcalino, lo cual no siempre es posible debido a la baja estabilidad de muchas enzimas a estos pHs. Dentro de este contexto, la preparación de soportes que contengan grupos capaces de adsorber enzimas a pH neutro y vía diferentes mecanismos o grupos funcionales, conteniendo también una elevada densidad de grupos glioxil permitiría solucionar los problemas anteriormente expuestos.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona soportes heterofuncionales que comprenden un soporte orgánico o inorgánico de base al que se le activan los grupos OH libres, silanoles, etc, para en un primer paso convertirlos en grupos epóxido que posteriormente se pueden convertir en grupos glioxil y grupos aniónicos, catiónicos o hidrofóbicos capaces de interaccionar en condiciones suaves de pH con distintos grupos o regiones de proteínas, particularmente enzimas, y así conseguir complejos soporte-proteína muy estables.
En un primer aspecto, la presente invención describe un soporte que contiene grupos activados que interaccionan con grupos presentes en las proteínas, donde dichos grupos activados son grupos glioxil y grupos de fórmula (I)
donde
X se selecciona entre N o S,
R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C15 sustituido o no sustituido o arilo sustituido o no sustituido,
R2 y R3 pueden estar ausentes.
El término "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 15 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico o un grupo sustituido o no sustituido seleccionado de entre amino, amido, éster carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido, alcóxido, tiol, amino, acilamino, ciano, carboxilato, carboxamida, carboxiéster, arilo o heteroarilo o combinaciones de estos grupos.
El término "arilo" se refiere en la presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 12 átomos de carbono, pudiendo ser de anillo único ó múltiple, en este último caso con anillos separados y/o condensados. Un ejemplo, no limitante, de arilo es un grupo fenilo.
En una realización preferida, el soporte se selecciona entre agarosa, resinas acrílicas o zeolitas. En la presente invención se entiende como soporte base un sólido de naturaleza orgánica o inorgánica que posee grupos susceptibles de ser modificados químicamente y aumentar así su capacidad de interaccionar mediante fuerzas de Van der Waals, enlaces iónicos o covalentes con grupos presentes en aminoácidos, tales como Lys, Arg etc. Otros ejemplos de posibles soportes base son nanopartículas magnéticas.
En una realización preferida, X es N.
En otra realización preferida, R1, R2 y R3 son independientemente grupos alquilo C1-C6, más preferiblemente R1, R2 y R3 son independientemente grupos alquilo C1-C6 lineales no sustituidos y aún más preferiblemente R1, R2 y R3 son etilo.
En otra realización preferida, R1 es hidrógeno y R2 y R3 son alquilo C1-C6 sustituido con un grupo COOH en el carbono terminal. Más preferiblemente, R2 y R3 son un grupo acetato.
En una realización aún más preferida, los grupos -COOH están unidos a un átomo metálico con capacidad quelante, preferiblemente Cu o Ni.
En otra realización preferida, R1 es un grupo arilo sustituido o no sustituido y R2 y R3 son H. Más preferiblemente R1 es un grupo fenil boronato.
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Reivindicaciones:
1. Soporte orgánico o inorgánico que comprende grupos activados que interaccionan con grupos presentes en las proteínas, donde dichos grupos activados son grupos glioxil y grupos de fórmula (I)
donde
X se selecciona entre N o S,
R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C15 sustituido o no sustituido o arilo sustituido o no sustituido,
R2 y R3 pueden estar ausentes.
2. Soporte según la reivindicación 1 que se selecciona entre agarosa, resinas acrílicas o zeolitas.
3. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde X es N.
4. Soporte según la reivindicación 3 donde R1, R2 y R3 son independientemente grupos alquilo C1-C6.
5. Soporte según la reivindicación 4 donde R1, R2 y R3 son independientemente grupos alquilo C1-C6 lineales no sustituidos.
6. Soporte según la reivindicación 5 donde R1, R2 y R3 son etilo.
7. Soporte según la reivindicación 3 donde R1 es hidrógeno y R2 y R3 son alquilo C1-C6 sustituido con un grupo COOH en el carbono terminal.
8. Soporte según la reivindicación 7 donde R2 y R3 son un grupo acetato.
9. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde los grupos -COOH están unidos a un átomo metálico.
10. Soporte según la reivindicación 9 donde el metal es Cu, Ni, Co o Zn.
11. Soporte según la reivindicación 3 donde R1 es un grupo arilo sustituido o no sustituido y R2 y R3 son H.
12. Soporte según la reivindicación 11 donde R1 es un grupo fenil boronato.
13. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde X es S.
14. Soporte según la reivindicación 13 donde R1 es un alquilo C1-C15 sustituido o sin sustituir.
15. Soporte según la reivindicación 14 donde R1 en undecanol.
16. Procedimiento de obtención de un soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende las siguientes etapas:
17. Procedimiento según la reivindicación 16 donde la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo con un epóxido halogenado.
18. Procedimiento según la reivindicación 17 donde el epóxido halogenado es epiclorhidrina o epibromhidrina.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 donde la oxidación de la etapa (c) se lleva a cabo con periodato de sodio.
20. Uso de un soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la inmovilización de proteínas.
21. Uso según la reivindicación 20 donde la proteína es una enzima.
22. Procedimiento de inmovilización de proteínas que comprende:
23. Procedimiento según la reivindicación 22 que se lleva a cabo a un pH comprendido entre 5 y 8.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23 que se lleva a cabo a una temperatura entre los 5 y 25ºC.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 que además comprende una etapa final de reducción del soporte con las proteínas inmovilizadas.
26. Complejo que comprende el soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y una proteína inmovilizada.
27. Uso del complejo según la reivindicación 26 como catalizador.
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