Sistema mejorado de PCR multicolor a tiempo real.

Un instrumento de PCR a tiempo real que incluye

* exactamente una fuente de luz monocromática,

donde la fuente de luz monocromática es un LED que emite a 470nm,

* 6 entidades detectoras de fluorescencia, cada una de las cuales tiene longitudes de onda de detección central a530, 555, 610, 640, 670 y 710 nm +/- 5 nm,

* múltiples recipientes de reacción para contener la mezcla de reacción,

* medios de calentamiento y refrigeración,

* un tubo de luz y 6 haces de fibra de vidrio,

caracterizado porque dichas entidades detectoras son capaces de

* detectar simultáneamente la emisión de fluorescencia máxima de al menos 4 pares de sondas de hibridación FRETmarcadas de manera diferente,

* detectar simultáneamente la emisión de fluorescencia máxima de al menos 2 sondas de hibridación TaqManmarcadas de manera diferente, y

* detectar la emisión de fluorescencia máxima de SybrGreenI y

que las unidades de excitación y detección están separadas mecánicamente y conectadas a un haz de seis fibras,donde cada haz de 50 μm de fibras de vidrio único transmite la luz a cada uno de los seis canales de detección.

Sistema mejorado de PCR multicolor a tiempo real Campo de la invención La presente invención está relacionada con el campo de la PCR a tiempo real. En concreto, la presente invención está dirigida hacia un instrumento para la realización de PCR multiplex a tiempo real.

Antecedentes de la invención La amplificación del DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental dentro de la biología molecular. El análisis de los ácidos nucleicos mediante la PCR requiere la preparación de la muestra, la amplificación y el análisis del producto. Pese a que la mayoría de las veces estos pasos se realizan secuencialmente, la amplificación y el análisis pueden llevarse a cabo simultáneamente. Antes de la amplificación, se pueden añadir a la mezcla de la PCR colorantes de DNA o sondas fluorescentes para analizar los productos de la PCR durante la amplificación. El análisis de la muestra tiene lugar simultáneamente a la amplificación, en el mismo tubo y dentro del mismo instrumento. Este enfoque combinado disminuye la manipulación de la muestra, ahorra tiempo y reduce en gran medida el riesgo de contaminación del producto para las siguientes reacciones, ya que no es necesario extraer las muestras de sus contenedores dosificados para el análisis posterior. El concepto de la combinación de la amplificación con el análisis del producto se conoce como PCR “a tiempo real”. Ver, por ejemplo, la patente U.S. 6.174.670.

Inicialmente, la monitorización de la fluorescencia durante cada uno de los ciclos de la PCR implicaba la utilización de bromuro de etidio (Higuchi R, G Dollinger, PS Walsh y R. Griffith, Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences, Bio/Technology 10 (1992) 413-417; Higuchi R, C Fockler G Dollinger y R Watson, Kinetic PCR analysis: real time monitoring of DNA amplification reactions, Bio/Technology 11 (1993) 1026-1030) . En ese sistema, la fluorescencia se mide una vez por ciclo como medida relativa de la concentración del producto. El bromuro de etidio detecta DNA bicatenario; si el molde está presente, la intensidad de la fluorescencia se incrementa con el ciclado de la temperatura. Además, el número de ciclo en el que se detecta el primer aumento de intensidad de la fluorescencia incrementa de manera inversamente proporcional al logaritmo de la concentración inicial del molde. Se han desarrollado otros sistemas de fluorescencia que son capaces de proporcionar información adicional en relación a la concentración y a la secuencia del ácido nucleico.

En la PCR a tiempo real cinética, la formación de los productos de la PCR se monitoriza en cada ciclo de la PCR. La amplificación se mide habitualmente en termocicladores que contienen aparatos adicionales para la medición de señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación.

Instrumentación de la PCR a tiempo real En la materia se conocen varios tipos de termocicladores de detección a tiempo real.

Por ejemplo, la patente PE 0 640 828, describe un aparato para la monitorización simultánea de la amplificación múltiple de ácidos nucleicos. Se caracteriza por tener un termociclador en forma de bloque metálico que incluye una porción conductora de calor que tiene múltiples hendiduras para poder acomodar una placa de múltiples pocillos, tal como una placa de microtitulación. La detección se obtiene mediante una cámara CCD configurada para detectar luz emitida (simultáneamente) por todos los pocillos mencionados. De forma alternativa, se sugiere la utilización de la fibra óptica. En relación a los colorantes fluorescentes que se utilizan, y de forma más importante, a la presencia de una rueda de filtros cerca de la cámara CCD, el sistema tiene la capacidad de analizar reacciones de amplificación multiplex, donde en una cámara de reacción se detectan uno o más amplicones diferentes mediante la utilización de 2 o más sondas de hibridación marcadas de forma diferente. Sin embargo, la patente PE 0 640 828 no anticipa ni sugiere qué marcadores o formatos de detección podrían utilizarse en tal enfoque multiplex/multicolor.

La patente US 6.015.674 describe un aparato y un sistema para la detección y cuantificación mediante PCR a tiempo real caracterizado por la capacidad de detectar el primer y el segundo indicadores de fluorescencia, que pueden utilizarse como marcadores para diferentes sondas de hibridación con el fin de detectar amplicones diferentes en el mismo recipiente de reacción. Sin embargo, la patente US 6.015.674 no describe un sistema para la realización de experimentos multiplex con un mayor grado de complejidad.

Otro ejemplo típico es el LightCycler de Roche Diagnostics (Nº de Cat. 2 0110468) . Es un sistema de PCR rápido que permite la cuantificación cinética de la PCR en línea y el posterior análisis de las curvas de fusión de los productos de la PCR. El sistema óptico de la versión actual del LightCycler (1.2) que se encuentra comercialmente disponible contiene una fuente de luz, un diodo emisor de luz azul (LED de 470 nm) , y tres canales de detección. Los productos de la amplificación se detectan mediante la utilización de sondas de hibridación marcadas con fluorescencia que sólo emiten señales fluorescentes cuando están unidas al ácido nucleico diana o, en algunos casos, mediante la utilización de colorantes fluorescentes que se unen a DNA bicatenario. Se define un umbral de

señal para cada reacción que va a analizarse y se determina el número de ciclos Cp que se requieren para alcanzar este valor umbral tanto para el ácido nucleico diana como para los ácidos nucleicos de referencia, tales como el gen constitutivo (housekeeping en inglés) o estándar. El número absoluto o relativo de copias de la molécula diana puede determinarse en base a los valores Cp obtenidos para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia.

La fluorescencia emitida por la muestra se separa mediante un juego de espejos dicroicos y filtros en diferentes longitudes de onda que pueden registrarse en uno de los tres canales de detección (530 / 640 / 710 nm) . Esto permite la detección del colorante SybrGreenI que se une a DNA bicatenario, la detección monocolor del formato de sonda TaqMan y la detección a color dual del formato de sondas de hibridación (HybProbe) . Los detalles del sistema Lightcycler se describen en las patentes WO 97/46707, WO 97/46712 y WO 98/46714.

Una característica muy importante del instrumento LightCycler es el programa de compensación de color. En principio, este programa permite la cuantificación precisa y el análisis de las curvas de fusión mediante la corrección del solapamiento espectral de la radiación fluorescente monitorizada de manera dependiente de la temperatura. Los detalles técnicos se describen en la patente US 6.197.520.

De forma similar al sistema LightCycler, el termociclador de PCR a tiempo real Rotor-Gene de Corbett (www.corbettresearch.com) es un sistema multiplex de 4 canales que incluye 4 LED diferentes como fuentes de excitación y sus fotodiodos correspondientes como unidades de detección de fluorescencia. Así, aunque al menos teóricamente, el hardware de este instrumento tiene la capacidad de llevar a cabo experimentos multiplex con hasta cuatro sondas de hibridación marcadas de forma diferente en un mismo recipiente de reacción, hasta la fecha no se ha publicado el protocolo respectivo para su aplicación exitosa.

Otro instrumento de PCR a tiempo real es el sistema de detección de PCR multicolor a tiempo real Biorad iQ (Nº Cat. 170-8740) , que permite la excitación de un fluoróforo y la emisión desde los 400 nm a los 700nm. El sistema se basa en un bloque de calentamiento convencional con múltiples pocillos para el termociclado, una lámpara de tungsteno como fuente de excitación, una rueda de filtros para proporcionar longitudes de onda de excitación adecuadas, una segunda rueda de filtros para la selección de las longitudes de onda de emisión adecuadas y una cámara CCD como unidad de detección. El instrumento se ha utilizado con éxito en un ensayo multiplex para la detección de 4 amplicones diferentes generados a partir de dianas con concentraciones aproximadamente equimolares, utilizando cuatro sondas TaqMan marcadas de forma diferente, en el mismo recipiente de reacción (Pedersen, S., Bioradiations 107 (2001) 10-11) .

En un enfoque adicional para aumentar las capacidades de multiplexado, la patente US 6.369.893 describe un instrumento de termociclado para PCR a tiempo real que incluye un primer ensamblaje de la óptica con al menos dos... [Seguir leyendo]

1. Un instrumento de PCR a tiempo real que incluye • exactamente una fuente de luz monocromática, donde la fuente de luz monocromática es un LED que emite a 470 nm, • 6 entidades detectoras de fluorescencia, cada una de las cuales tiene longitudes de onda de detección central a 530, 555, 610, 640, 670 y 710 nm +/- 5 nm, • múltiples recipientes de reacción para contener la mezcla de reacción, 10 • medios de calentamiento y refrigeración, • un tubo de luz y 6 haces de fibra de vidrio, caracterizado porque dichas entidades detectoras son capaces de • detectar simultáneamente la emisión de fluorescencia máxima de al menos 4 pares de sondas de hibridación FRET marcadas de manera diferente,

• detectar simultáneamente la emisión de fluorescencia máxima de al menos 2 sondas de hibridación TaqMan marcadas de manera diferente, y

• detectar la emisión de fluorescencia máxima de SybrGreenI y

que las unidades de excitación y detección están separadas mecánicamente y conectadas a un haz de seis fibras, donde cada haz de 50 µm de fibras de vidrio único transmite la luz a cada uno de los seis canales de detección.