SISTEMA DE VECTORIZACIÓN QUE COMPRENDE NANOPARTÍCULAS DE TAMAÑO HOMOGENEO DE AL MENOS UN POLIMERO Y DE AL MENOS UN POLISACARIDO CARGADO POSITIVAMENTE Y SU PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN.

Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés terapéutico o de diagnóstico del tipo constituido por nanopartículas,

caracterizado porque dichas nanopartículas presentan una distribución de tamaño homogénea y comprenden (i) al menos un polímero y (ii) al menos un polisacárido cargado positivamente no tóxico.

Sistema de vectorización que comprende nanopartículas de tamaño homogéneo de al menos un polímero y de al menos un polisacárido cargado positivamente y su procedimiento de preparación La invención se refiere al suministro de principios activos usados especialmente en el campo de los medicamentos de tratamiento preventivo, curativo o diagnóstico. Tiene más particularmente por objeto un sistema de suministro y de vectorización de sustancias de interés constituido por nanopartículas basadas en al menos un polímero, preferiblemente un poli (cianoacrilato de alquilo) , y al menos un polisacárido cargado positivamente, preferiblemente un quitosano de bajo peso molecular, y sustancias de interés aniónicas, o que comprenden una región aniónica, adheridas o incorporadas al nivel de dichas nanopartículas.

La puesta a punto de nuevos sistemas de suministro o de liberación de principios activos tiene como objetivo primario el suministro controlado de un agente activo, especialmente farmacológico, a su sitio de acción a una velocidad y con una posología terapéuticamente óptimas (J. Kreuter, 1994) . Se puede citar también la mejora del índice terapéutico, que puede obtenerse mediante la modulación de la distribución del principio activo en el organismo. La asociación de principio activo con el sistema de suministro permite especialmente su suministro específico al sitio de acción o su liberación controlada después de la orientación al sitio de acción. La reducción de la cantidad de principio activo en los compartimentos en que su presencia no es deseable permite elevar la eficacia de dicho principio activo y reducir sus efectos secundarios tóxicos, hasta incluso modificar o restaurar su actividad.

Una de las cuestiones principales del suministro es su aplicación a la biología molecular y muy particularmente la aplicación a principios activos como ácidos desoxirribonucleicos (ADN) , oligodesoxinucleótidos (ODN) , péptidos y proteínas, cargados todos negativamente. La comprensión de las bases de la biología molecular en las enfermedades genéticas permite modular o reemplazar un gen disfuncional. El desarrollo de la terapia génica rutinaria en la práctica clínica depende de la posibilidad de administración por vía sistémica de forma repetida, de la capacidad de alcanzar una diana y de transfectar eficazmente células in vivo (Felgner, 1990, Kabanov y Alakhov, 1993, Crook, 1995, Douglas y Curiel, 1995, Lasic y Templeton, 1996) así como de la posibilidad de fabricar vectores que sean capaces de trasladarse a escala industrial. Las técnicas de transfección in vitro usadas hasta ahora, como electroporación y coprecipitación de ADN con fosfato de calcio, son enfoques cuya aplicación in vivo parece difícil (Fynan et al., 1993) .

Los sistemas usados actualmente para la transfección in vivo tienen en cuenta la carga natural negativa de ADN u ODN. Son sistemas víricos (Morgan y Anderson, 1993) o bien construcciones no víricas como lípidos catiónicos (Ledley, 1994, Zelphati y Szoka, 1996) . Los vectores víricos son muy eficaces en términos de transfección in vitro, pero poseen limitaciones in vivo debido a su inmunogenicidad (Wilson et al., 1990, Douglas y Curiel, 1995; Verma y Somia, 1997) . Entre los vectores no víricos, los lípidos catiónicos tales como transfectamo (Behr et al., 1989) presentan buenas propiedades de transfección, pero su aplicación in vivo está limitada por su toxicidad, la activación del complemento y su fuerte tropismo por hígado y pulmones.

Desde los estudios efectuados con poli- (1-lisina) a finales de los años 80 (Wu y Wu, 1987) , se han estudiado varios polímeros catiónicos como vectores de transfección no víricos. Estos vectores incluyen polietilenimina (Boussif et al., 1995; Remy et al., 1998) , polibreno (Mumper et al., 1996) y dendrímeros de poli (amidoamina) (PAMAM) (Tang et al., 1996) .

Hasta ahora, la eficacia de la transfección con polímeros es relativamente baja y muchos de estos polímeros catiónicos han mostrado una toxicidad relativa con bajos potenciales de administración repetida por vía intravenosa. Los polímeros usados directamente con los principios activos, especialmente ADN, están limitados por su eficacia de transfección y consumen una gran cantidad de principio activo y por ello obligan a usar una gran cantidad de polímero que resulta tóxica. Los sistemas coloidales usados para el suministro especialmente de genes in vivo economizan más polímeros y principio activo.

Los sistemas coloidales de suministro de principios activos comprenden liposomas, microemulsiones, nanocápsulas, nanosferas, micropartículas y nanopartículas. Las nanopartículas presentan ventajas de orientación, modulación y distribución y de flexibilidad de formulación, y tienen una estructura polimérica que puede concebirse y realizarse de forma adaptada al fin perseguido. Se revelan muy particularmente prometedoras para obtener un mejor índice terapéutico en el sentido definido anteriormente, a causa de su aptitud para asegurar una liberación controlada, un suministro específico al sitio de acción o suministro orientado, que permite a la vez un aumento de la eficacia y una reducción de los efectos secundarios tóxicos al nivel de otros órganos.

Entre estos, los poli (cianoacrilatos de alquilo) descritos en los documentos EP-B-0.007.895 (US-A-4.329.332 y USA-4.489.055) , FR 2.649.321-A, FR 2.724.935-A y EP-B-0.064.967 (US-A-4.913.908) son particularmente interesantes puesto que se observa rápidamente su bioerosión con respecto a otros polímeros biodegradables y se desarrolla durante periodos compatibles con las aplicaciones terapéuticas o diagnósticas. Las nanopartículas son vectores coloidales cuyo diámetro varía entre 10 nm y 1000 nm. Estas partículas están formadas por macromoléculas en las que la sustancia biológicamente activa se pliega, encapsula o adsorbe en la superficie. Las nanopartículas o nanoesferas se han descrito por Birrenbach y Speiser (1976) en términos de “nanoaglomerados” y nanocápsulas y se califican por Kreuter y Speiser (1976) como “coadyuvantes” y “sistemas de suministro de sustancias activas” por Kreuter (1983) .

Con el fin de aumentar la estabilidad de los oligonucleótidos, de aumentar su penetración en las células y de evitar la distribución no específica, se considera el uso de vectores particulares, como nanopartículas, como un enfoque de los más prometedores. Sin embargo, su uso ha estado limitado por la toxicidad de la sustancia usada para fijar el principio activo a la nanopartícula.

Las nanopartículas poliméricas más estudiadas son los poliisohexilcianoacrilatos (PIHCA) . Sin embargo, estas nanopartículas presentan una carga negativa en superficie; se han combinado un copolímero catiónico (dietilaminoetil (DEAE) -dextrano) o un detergente hidrofóbico catiónico (bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) ) con polialquilcianoacrilatos (PACA) con el fin de facilitar la asociación de los ODN mediante la formación de pares iónicos sobre las nanopartículas. Así, los ODN se han asociado eficazmente a nanopartículas de PACA que contenían un catión hidrofóbico tal como CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio, Chavany et al., 1992) . El CTAB presenta problemas de toxicidad; Zobel et al., 1987 han reemplazado al CTAB por DEAE-dextrano, que se ha introducido en el medio de polimerización antes de la formación de las nanoesferas. El DEAE-dextrano se ha comprobado igualmente tóxico.

El vector nanoparticulado ideal para el suministro de principios activos como ADN, ODN, péptidos y proteínas debe:

- poder formar un complejo con la molécula de interés teniendo en cuenta sus características fisicoquímicas y la sustancia elegida para fijar el principio activo, y debe adaptarse a la carga y a los datos de toxicidad,

- poder proteger al principio activo de la degradación durante su transporte por la circulación sanguínea,

- ser biocompatible (no tóxico, no inmunogénico y preferiblemente biodegradable) ,

- poder suministrar el principio activo al nivel del tejido diana en cantidad suficiente, y

- poder orientarse específicamente a un tipo celular.

Este fin se consigue gracias al uso de nanopartículas poliméricas, en particular de poli (cianoacrilatos de alquilo) asociados a uno o varios polisacáridos cargados positivamente.

La invención tiene por tanto como objeto un sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés terapéutico o diagnóstico, del tipo constituido por nanopartículas, caracterizado porque dichas nanopartículas presentan una distribución... [Seguir leyendo]

1. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés terapéutico o de diagnóstico del tipo constituido por nanopartículas, caracterizado porque dichas nanopartículas presentan una distribución de tamaño homogénea y comprenden (i) al menos un polímero y (ii) al menos un polisacárido cargado positivamente no tóxico.

2. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas sustancias se internalizan o adsorben al nivel de dichas nanopartículas.

3. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque las sustancias de interés son aniónicas o comprenden una región aniónica.

4. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polímero es un poli (cianoacrilato de alquilo) en el que el grupo alquilo, lineal o ramificado, comprende de 1 a 12 átomos de carbono.

5. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polisacárido cargado positivamente es quitosano o uno de sus derivados.

6. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el polisacárido cargado positivamente, muy particularmente quitina o uno de sus derivados, tiene una masa molecular inferior a 100.000 Da, preferiblemente inferior as 30.000 Da.

7. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las nanopartículas comprenden al menos un compuesto apto para complejar las sustancias de interés.

8. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según la reivindicación 7, caracterizado porque el compuesto apto para complejar las sustancias de interés es un oligosacárido cíclico, preferiblemente una ciclodextrina neutra o cargada, nativa, ramificada o polimerizada o modificada químicamente.

9. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las sustancias de interés se eligen del grupo de compuestos químicos que comprende ADN u oligodesoxirribonucleótidos u oligorribonucleótidos, especialmente anticodificantes,

o ARN interferente (ARNip) , o incluso péptidos, polipéptidos o proteínas.

10. Sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las nanopartículas presentan un diámetro homogéneo comprendido entre 10 y 300 nm.

11. Procedimiento de preparación de nanopartículas que entran en la composición de un sistema de vectorización y de suministro de sustancias de interés según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende la polimerización a pH ácido superior a 1 de monómeros en presencia del polisacárido cargado positivamente para obtener una suspensión de nanopartículas.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el polisacárido se añade al inicio de la polimerización.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque el pH ácido es superior a

3.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la polimerización se realiza en presencia de un compuesto retardante de la polimerización como SO2 o hidroquinona, que se fija en los grupos OH del medio acuoso de polimerización o del polisacárido.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la cantidad de polisacárido está ventajosamente comprendida entre 0, 01% y 5%, y preferiblemente entre 0, 1 y 1%, con respecto al peso de la suspensión.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque comprende la adición de poliisohexilcianoacrilato que contiene SO2 en una solución de ácido cítrico a un pH comprendido entre 1 y 5 que contiene un tensioactivo no iónico, eventualmente ciclodextrina y quitosano de bajo peso molecular (5.000 o 10.000 Da) .

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque comprende la adición de las sustancias de interés al mismo tiempo que el polisacárido.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque comprende la adición de las sustancias de interés después de la formación de las nanopartículas.

19. Una suspensión de nanopartículas susceptible de obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, caracterizado porque comprende de 0, 01% a 5%, en particular entre 0, 1% y 1%, de polisacárido cargado positivamente con respecto al peso de la suspensión.

20. Una suspensión de nanopartículas según la reivindicación 19, caracterizada porque comprende de 0, 5 a 50% de sustancias de interés con relación al peso de la suspensión.

Fig. 1

Fig. 2

Fig.3

Fig. 4

Fig. 5

Fig. 6

Fig. 7

Fig. 8

Fig. 9

Fig. 10

Fig. 11 Fig. 12 Fig. 13 Fig. 14 Fig. 15

Fig. 16

Fig. 17

Fig. 18