Electrotransferencia de ácidos nucleicos en células tisulares.

Uso de un ácido nucleico para la preparación de un medicamento destinado a ser transferido in vivo en células tisulares,

en el que el medicamento se pone en contacto con las células tisulares, y el tejido es estimulado eléctricamente como sigue:

- en primer lugar con al menos un pulso con una intensidad de campo de alto voltaje de entre 200 y 2.000 volts/cm

- en segundo lugar con un pulso individual de bajo voltaje con una intensidad de campo de entre 50 y 200 volts/cm y una duración de entre 300 y 2.000 ms.

Electrotransferencia de ácidos nucleicos en células tisulares [0001] La presente invención se refiere a la transferencia génica por mediación eléctrica de ácidos nucleicos en células tisulares, en particular en células musculares o tumorales.

La transferencia génica por mediación eléctrica, también denominada electrotransferencia de ADN o electrogenterapia, ha adquirido un interés real ya que es uno de los métodos más eficaces de transferencia génica no vírica in vivo (Andre y Mir, 2004) . El método ha demostrado ser eficaz para electrotransferir ADN de plásmido a varios tejidos: músculos (Aihara y Miyazaki, 1998; Mir y col., 1998a; Mir y col., 1999) , hígado (Heller y col., 1996; Suzuki y col., 1998) , piel (Titomirov y col., 1991; Zhang y col., 1996) , tumores (Heller y col., 2000; Wells y col., 2000; Heller y Coppola, 2002) , testículos de ratón (Muramatsu y col., 1997; Muramatsu y col., 1998) , etc. (Andre y Mir, 2004) .

Los mecanismos por los que los pulsos eléctricos median en la transferencia de ADN a las células objetivo no son bien comprendidos. No obstante, existe un acuerdo común en que para una transferencia de ADN mejorada en tejidos, las células del tejido deben ser permeabilizadas. Dicha permeabilización puede conseguirse mediante el uso de simples series de pulsos eléctricos cortos de onda cuadrada (en el intervalo de 100 µs) (Mir y

col., 1991b; Gehl y col., 1999; Miklavcic y col., 2000) . Este tipo de pulsos se ha usado ampliamente para la administración local de fármacos antineoplásicos no permeantes (como bleomicina o cisplatino) en un tratamiento denominado "electroquimioterapia antitumoral" (Mir y col., 1991a; Glass y col., 1997; Sersa y col., 1998; Mir y col., 1998b; Rodríguez y col., 2002) . De hecho, la administración a tumores de, por ejemplo, 8 pulsos de 1.300 V/cm y 100 µs tanto in vitro como in vivo es suficiente para inducir unas reestructuraciones transitorias de la membrana celular que permiten que moléculas antineoplásicas no permeantes como la bleomicina entren en la célula mediante difusión y ejerzan completamente su actividad citotóxica (Poddevin y col., 1991; Mir y col., 1991b; Gehl y col., 1998) .

Estos cortos pulsos eléctricos permeabilizantes también han demostrado aumentar la transferencia de ADN de plásmido en varios tejidos (Heller y col., 1996; Heller y col., 2000) . Sin embargo, se aplicó otro tipo de pulsos 30 eléctricos de onda cuadrada a músculos (Aihara and Miyazaki, 1998; Mir y col., 1999) , tumores (Rols y col., 1998) , hígado (Suzuki y col., 1998) y algunos otros tejidos (Andre and Mir, 2004) , y se averiguó que eran más eficaces para la electrotransferencia de ADN (Mir y col., 1999; Heller y col., 2000) . Estos pulsos son habitualmente de un voltaje menor pero de mucha más duración (en el intervalo de décimas de milisegundos) (Aihara y Miyazaki, 1998; Rols y col., 1998; Mir y col., 1999; Bettan y col., 2000; Matsumoto y col., 2001) . Se asume que este tipo de pulsos median en la transferencia de ADN en las células mediante la inducción de dos efectos distintos que incluyen la permeabilización celular (como los pulsos cortos) y la migración electroforética del ADN durante el suministro del campo eléctrico (Klenchin y col., 1991; Sukharev y col., 1992; Neumann y col., 1996; Mir y col., 1999; Golzio y col., 2002) .

Se ha descrito una electrotransferencia eficiente en células musculares en el documento WO-A99/01158 mediante el uso de una o más (hasta 100.000) impulsiones eléctricas unipolares de 1 - 800 volts/cm, y en el documento WO-A-98143702 mediante el uso de una estimulación con una corriente eléctrica de 5 - 200 volts/cm, en la que la corriente eléctrica puede estar en forma de 2 - 30.000 pulsos bipolares cuadrados.

El doble papel de los pulsos eléctricos sobre la electrotransferencia de ADN in vivo fue demostrado mediante el uso de combinaciones de pulsos eléctricos que consisten en pulsos cortos de alto voltaje (o HV; por ejemplo, de 800 V/cm y 100 µs) seguido de pulso largos de bajo voltaje (o LV; por ejemplo, de 80 V/cm y 100 ms) (Bureau y col., 2000; Satkauskas y col., 2002) . En este último estudio se ha demostrado que estos pulsos de HV y LV pueden estar separados por varios lapsos entre el HV y el LV sin una pérdida significativa en la eficacia de 50 transfección. Estos lapsos varían en combinaciones de hasta 300 s durante 1 HV y 1 LV, y hasta 3.000 s durante 1 HV y 4LV (Satkauskas y col., 2002) .

El solicitante ha averiguado que todavía era posible mejorar la eficacia de electrotransferencia mediante el uso de una combinación específica de pulsos HV y LV.

La transfección de tumores y/o de otros tejidos, por ejemplo, de hígado, también puede ser de interés para similar La intensidad de campo eléctrico preferida (en V/cm) para el HV y/o el LV cambiará dependiendo de los tejidos.

Un primer objeto de la invención es por tanto el uso de un ácido nucleico para la preparación de un medicamento o fármaco humano o veterinario destinado a ser transferido in vivo en células tisulares, en el que el medicamento se pone en contacto con las células tisulares, y el tejido es estimulado eléctricamente como sigue:

- en primer lugar con al menos un pulso de alto voltaje (HV) con una intensidad de campo de entre 200 y 2.000 volts/cm

-en segundo lugar con un pulso individual de bajo voltaje (LV) con una intensidad de campo de entre 50 y 200 volts/cm y una duración de entre 300 y 2.000 ms.

Según se usa en este documento, el término "tejido" representa un tejido tumoral o no tumoral de un animal, por ejemplo, de un ser humano, o de un mamífero no humano, tal como un roedor (por ejemplo, un ratón, un conejo o una rata) , un perro, un gato o un primate. Un tejido no tumoral puede ser un músculo, especialmente músculo esquelético, o el hígado.

De acuerdo con una forma de realización, el tejido es un músculo. Para este tipo de tejido, aunque no exclusivamente, se prefiere que el tejido sea estimulado eléctricamente en primer lugar con al menos un pulso de HV con una intensidad de campo de entre 200 y 1.400 volts/cm.

De acuerdo con otra forma de realización, el tejido es un tejido tumoral. Para este tipo de tejido, aunque no exclusivamente, se prefiere que el tejido sea estimulado eléctricamente en primer lugar con al menos un pulso de HV con una intensidad de campo de entre 400 y 2.000 volts/cm.

Preferiblemente, el medicamento está destinado a entrar en contacto con las células tisulares antes de aplicar el pulso individual de LV, y aún más preferiblemente, antes de la aplicación del pulso o pulsos de HV. El tiempo entre la inyección del ácido nucleico y el pulso eléctrico, especialmente entre la inyección y el pulso o pulsos de HV, no es crítico. Típicamente, el medicamento se ha puesto en contacto con las células tisulares desde unos pocos segundos antes hasta 10 minutos, por ejemplo, entre 30 s y 5 minutos. También es aceptable un intervalo de 5 a 10 minutos antes del pulso o pulsos de HV. El medicamento puede ponerse en contacto a través de una inyección intramuscular directa, a través de una administración sistémica (por ejemplo, por vía intravenosa o intraarterial) o mediante una administración tópica o subcutánea.

En un aspecto ventajoso de la invención, en particular para un músculo, el pulso individual de LV tiene una intensidad de campo de entre 50 y 140 volts/cm, especialmente de entre 80 y 120 volts/cm, preferiblemente de 35 entre 90 y 110 volts/cm, típicamente de aproximadamente 100 volts/cm.

En un aspecto ventajoso de la invención, en particular para un tejido tumoral, el pulso individual de LV tiene una intensidad de campo de entre 100 y 200 volts/cm, preferiblemente de entre 120 y 160 volts/cm, típicamente de aproximadamente 140 volts/cm.

En otro aspecto ventajoso de la invención, para el músculo y el tejido tumoral, el pulso individual de LV tiene una duración de entre 300 y 800 ms, preferiblemente de entre 350 y 600 ms, típicamente de aproximadamente 400 ms.

El pulso de LV puede tener la misma polaridad que el pulso de HV.

Sin embargo, de acuerdo con un aspecto ventajoso, el pulso de LV tiene una polaridad opuesta a la del pulso de HV.

Preferiblemente, el pulso individual de LV es un pulso cuadrado. También puede ser trapezoidal o discontinuo.

Sin estar ceñidos a ninguna teoría, se considera que el pulso individual de LV de acuerdo con la invención mejora al menos la migración electroforética del ácido nucleico.

Pueden realizarse varios pulsos de HV, es decir, entre 2 y 10 pulsos de HV con las especificaciones desveladas en los mismos. En este caso es más conveniente tener pulsos de HV idénticos.

1. Uso de un ácido nucleico para la preparación de un medicamento destinado a ser transferido in vivo en células tisulares, en el que el medicamento se pone en contacto con las células tisulares, y el tejido es estimulado 5 eléctricamente como sigue:

- en primer lugar con al menos un pulso con una intensidad de campo de alto voltaje de entre 200 y 2.000 volts/cm

-en segundo lugar con un pulso individual de bajo voltaje con una intensidad de campo de entre 50 y 200 volts/cm y 10 una duración de entre 300 y 2.000 ms.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una intensidad de campo de entre 50 y 140 volts/cm.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una intensidad de campo de entre 80 y 120 volts/cm.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una intensidad de campo de entre 90 y 110 volts/cm. 20

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una intensidad de campo de 100 volts/cm.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se hace uso del alto 25 voltaje con una intensidad de campo de entre 200 y 1.400 volts/cm.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad de campo de entre 400 y 1.200 volts/cm.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad de campo de entre 600 y 800 volts/cm.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad de campo de 700 volts/cm. 35

10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tejido es un músculo.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una

intensidad de campo de entre 100 y 200 volts/cm. 40

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una intensidad de campo de entre 120 y 160 volts/cm.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una 45 intensidad de campo de 140 volts/cm.

14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 11 a 13, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad de campo de entre 400 y 2.000 volts/cm.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad de campo de entre 800 y 1.600 volts/cm.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad

de campo de entre 900 y 1.200 volts/cm. 55

17. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 14, en el que se hace uso del alto voltaje con una intensidad de campo de 1.000 volts/cm.

18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 11 a 17, en el que el tejido es un

tejido tumoral.

19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el pulso individual de

bajo voltaje tiene una duración de entre 300 y 800 ms. 5

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una duración de entre 350 y 600 ms.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una 10 duración de 400 ms.

22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el pulso individual de bajo voltaje tiene una polaridad que es opuesta a la del pulso de alto voltaje.

23. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que se usa un pulso individual de alto voltaje.

24. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que se hace uso de pulso (s) de un campo de alto voltaje con una duración de entre 10 y 1.000 µs. 20

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que use se hace uso de pulso (s) de un campo de alto voltaje con una duración de entre 50 y 200 µs.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, en el que use se hace uso de pulso (s) de un campo de alto 25 voltaje con una duración de 100 µs.

27. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pulso de alto voltaje y el pulso de bajo voltaje están separados por un lapso.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el lapso es de entre 300 ms y 3.000 s.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el lapso es de entre 500 ms y 1.000 s.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el lapso es de 1.000 ms. 35

31. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico es capaz de producir una molécula terapéuticamente activa o varias moléculas terapéuticamente activas en las células tisulares.

32. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se hace uso de dos o más ácidos nucleicos capaces de producir diferentes terapéuticamente activos en las células tisulares.

33. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico codifica para la proteína RDD o para un fragmento eficiente de la misma. 45

34. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es eficiente para reducir o suprimir la angiogénesis tumoral.

35. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento 50 reduce o suprime el crecimiento tumoral.

36. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento inhibe la metástasis.

37. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento es contra el cáncer.

38. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 19 a 32, en el que el tejido es un músculo y el ácido nucleico codifica para uno o varios inmunógenos.

39. El uso de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el (los) inmunógeno (s) es/son inmunógeno (s) frente al VIH.

40. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 19 a 37, en el que dicho tejido es un músculo.

41. Uso de un ácido nucleico que es capaz de expresar una molécula en la preparación de un medicamento o un fármaco para su uso en un método para administrar dicho ácido nucleico a células tisulares, 10 especialmente a células tisulares tumorales o no tumorales, por ejemplo, a células musculares, en el que a) dicho ácido nucleico va a ser inyectado en el tejido b) el tejido es estimulado eléctricamente como sigue:

-en primer lugar con al menos un pulso de alto voltaje (HV) con una intensidad de campo de entre 200 y 2.000 volts/cm

- en segundo lugar con un pulso individual de bajo voltaje (LV) con una intensidad de campo de entre 50 y 200

volts/cm y una duración de entre 300 y 2.000 ms. 20

42. Método para la producción de anticuerpos, especialmente de anticuerpos policlonales, que comprende la inyección de un ácido nucleico que codifica para un inmunógeno en un tejido, especialmente un músculo, de un animal vivo no humano, y la estimulación eléctrica del tejido como sigue:

-en primer lugar con al menos un pulso de alto voltaje (HV) con una intensidad de campo de entre 200 y 2.000 volts/cm

-en segundo lugar con un pulso individual de bajo voltaje (LV) con una intensidad de campo de entre 50 y 140 volts/cm y una duración de entre 300 y 2.000 ms.

siendo el ácido nucleico transferido a las células tisulares como resultado de esta estimulación eléctrica, y expresando en dicho hospedador un inmunógeno capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en el hospedador, y recuperar los anticuerpos.