Sistema de biosensor de afinidad electroquímica y métodos de utilización.

Un compuesto de fórmula II:

en el que R y R1 son los mismos o diferentes y cada uno puede seleccionarse entre:

2,2'-bipiridilo, 4,4'-disustituido-2,2'- bipiridilo, 5-5'-disustituido-2,2'-bipiridilo, 1,10-fenantrolinilo, 4,7-disustituido-1,10-fenantrolinilo, 5,6-disustituido- 1,10-fenantrolinilo, o N, N'-dimetil 2,2'-biimidazol, en el que cada sustituyente es un grupo metilo, etilo, o fenilo, y en el que los grupos R y R1 están coordinados con osmio a través de sus átomos de nitrógeno; R2 es hidrógeno, metilo, o etilo; --L--es un enlazante; E es un enlazante trivalente; B es un grupo que comprende un ligando capaz de unirse a una pareja de unión de analito específica; Z es cloro o bromo; X es un contraión; y y se selecciona para proporcionar una sal neutra; y m es de 2 a 4.

Sistema de biosensor de afinidad electroquímica y métodos de utilización.

Antecedentes de la invención

La presente invención describe un sistema, y métodos para detectar analitos en fluidos y está relacionada con reactivos para detectar analitos en fluidos. Más específicamente, pero no exclusivamente, la presente invención está dirigida a reactivos para detectar y analizar analitos en muestras de fluido y describe métodos para ello, y sistemas de inmunoensayo electroquímico.

Los biosensores electroquímicos se han utilizado en el diagnóstico in vitro para determinar la presencia y concentración de ciertos analitos biológicamente significativos en muestras biológicas como sangre, orina, y saliva. La monitorización diabética de la glucosa en sangre ha sido una de las aplicaciones comerciales más comunes y exitosas de biosensores electroquímicos. Se han desarrollado otras aplicaciones de biosensores para diagnóstico e incluye lactato, colesterol, creatinina, gases en sangre, y electrolitos. Ambas técnicas de medición electroquímica AC y DC se utilizan incluyendo amperometría, potenciometría, coulometría, e impedancia. La mayoría de las tecnologías de los biosensores actuales recae sobre enzimas libres seleccionadas, como elemento de bio-reconocimiento de los analitos. Además, esta tecnología normalmente puede medir de forma ajustada una concentración relativamente alta de analitos en el rango mM. En consecuencia, la detección electroquímica puede conseguirse utilizando un macro electrodo sin la utilización de técnicas de amplificación.

Otros analitos de interés se encuentran en concentraciones mucho más bajas en comparación con la glucosa. Dichos analitos incluye: drogas de abuso, como, anfetamina, cocaína, fenciclidina (PCP) , y tetrahidrocannabinol (THC) ; agentes terapéuticos, como, teofilina, digoxina, digitoxina, y metotrexato; contaminantes ambientales, como, PCB y atrazina; agentes de guerra biológica, como, ántrax, botulismo, y sarin; proteínas; y hormonas.

Varias técnicas de ensayo basadas en la afinidad que utilizan marcadores se han explorado para detectar estos analitos. Las técnicas basadas en la afinidad incluyen el uso de: marcajes enzimáticos, marcajes radioisotópicos, marcajes quimioluminiscente, marcajes fluorescentes, y marcajes rédox electroquímicos. No obstante, muchas de estas técnicas requieren mucho trabajo y muchos pasos que se realizan mejor en un laboratorio por un experto en la materia. El número y complejidad de pasos prohíben el uso rutinario de estas técnicas "en el campo". Muchas de estas pruebas utilizan variaciones en los ensayos competitivos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) . Los ejemplos incluyen ensayos de atrazina a partir de Strategic Diagnostics y EnviroLogix, Inc. ambos poseen muchos pasos manuales que incluye una incubación de 15 minutos y de 1 hora respectivamente. Pueden encontrarse otros ensayos basados en ELISA similares y otros formatos de inmunoensayo que pueden aplicarse a diversos grupos de ensayos en muchas industrias pero pocas son capaces de un ensayo cuantitativo in situ rápido. Uno de los formatos de inmunoensayo más comúnmente disponibles que se usan para las pruebas rápidas o dispositivos de punto de atención se conocen como ensayos de flujo lateral y utilizan inmunocromatografía. La mayoría de estos productos son los "ensayos de selección" que proporcionan un resultado cualitativo (positivo / negativo) indicado por la presencia o ausencia de una línea. Los resultados suelen ser de lectura visual y a menudo son difíciles de interpretar cuando están presentes líneas parciales o pequeñas. La mayoría de estos ensayos requieren un seguimiento con otro método como GC / MS o HPLC si el resultado es positivo. Hay una gran necesidad de proporcionar una tecnología para estas diferentes industrias para permitir una rápida detección basada en la afinidad. La rápida detección permite rápidos resultados fiables.

El uso de marcajes rédox electroquímicos, que también se denominan agentes de transferencia de electrones o marcajes de mediadores electroquímicos, han demostrado proporcionar resultados prácticos y fiables en ensayos electroquímicos basados en la afinidad. No obstante, el uso de técnicas de detección electroquímica para cuantificar los marcadores rédox y, en consecuencia, correlacionar la concentración de los marcadores rédox con la concentración del analito, no ha sido sin problemas. Las mediciones electroquímicas están sujetas a muchas influencias que afectan la sensibilidad y precisión de las mediciones, incluyendo las relacionadas con la selección apropiada del conjugado mediador a las variaciones en la estructura del electrodo en sí y / o los efectos de matriz derivada de la variabilidad de las muestras.

US 5.589.326 y WO 96/25514 describen complejos de osmio mononuclear que comprende dos ligandos bidentados y un enlace imidazol mediante sus átomos de nitrógeno del anillo con el osmio central. Estos complejos de osmio pueden utilizarse como mediadores rédox especialmente en los biosensores electroquímicos. Nakabayashi et al., Sensors and Actuators B 66 (2000) : 128-130 examinó la evaluación de los complejos de Os (II) como mediadores accesibles para los biosensores. Los complejos de Os (II) mononuclear se sintetizaron y los potenciales rédox de los complejos de Os (III/II) pudieron disminuirse mediante el uso de 4, 4’- dimetil-2, 2’-bipiridina, imidazol e ion cloruro como ligandos. US 2003/0096997 describe complejos metálicos de transición mononucleares y su uso como mediadores rédox. Como átomo de metal se utiliza cobalto, hierro, rutenio, osmio, o vanadio. Dos ligandos bidentados y otros dos ligandos están unidos al metal central. Csöregl et al., Anal. Chem. 1994, 66, 3131-3138 describe una capa sensible a la glucosa hecha por entrecruzamiento de glucosa oxidasa con un polímero derivado de poli (vinilimidazol) , mediante la formación de complejos mediante parte de los imidazoles con [Os (bipiridina)

2Cl]+/2 +.

Muchos inmunoensayos requieren un límite de detección mucho más bajo de lo que es actualmente posible con la detección electroquímica sobre un macroelectrodo convencional. Por lo tanto, las técnicas de amplificación de señales deben utilizarse para estos ensayos para mejorar significativamente el límite de detección electroquímico.

A la luz de los problemas descritos anteriormente, hay una necesidad continua de avances en el campo relevante, incluyendo sistemas mejorados, métodos, composiciones, y reactivos relacionados con la mejora de los análisis de detección de diversos analitos, incluyendo fármacos terapéuticos, drogas de abuso, estado de la enfermedad, analitos para las pruebas de alimentos, analitos de importancia ambiental, y agentes de guerra biológica. La presente invención representa dicho avance y proporciona una serie de beneficios y ventajas.

Resumen de la invención

En una forma, la presente Invención proporciona nuevas especies electroquímicas basadas en osmio que pueden utilizarse en los inmunoensayos. Las especies de osmio pueden acoplarse a un ligando de unión específico para detectar analitos de interés. Las especies de osmio pueden incluir 1, 2, o 4 centros de osmio que se acoplan a los ligandos de unión específico usando una variedad de grupos de unión. Los grupos de unión pueden seleccionarse para tipos específicos de analitos o para dar cabida a las diferentes propiedades presentadas por los analitos. Por ejemplo, el grupo de unión se puede seleccionar para impartir diferentes grados de hidrofilicidad (o por el contrario propiedades hidrofóbicas) .

Las nuevas especies electroquímicas basadas en osmio pueden utilizarse para detectar y analizar una variedad de analitos de interés, por ejemplo, agentes de guerra biológica, agentes terapéuticos, contaminantes ambientales, proteínas, y hormonas.

Las especies electroquímicas basadas en osmio pueden utilizarse junto con diferentes sensores de prueba y equipos de diagnóstico. En una forma, las especies electroquímicas basadas en osmio se utilizan en un inmunoensayo homogéneo para detectar los analitos de interés. Las técnicas de ensayo descritas por la presente invención pueden utilizarse con diferentes sensores de prueba ÿ medidores. Las técnicas de ensayo pueden utilizarse para analizar muestras que contengan una concentración especialmente baja del analito deseado. Las técnicas de ensayo pueden utilizarse para proporcionar resultados fiables de ensayo dentro de un tiempo muy corto de prueba - preferiblemente... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula II:

en el que R y R1 son los mismos o diferentes y cada uno puede seleccionarse entre: 2, 2’-bipiridilo, 4, 4’-disustituido

2, 2’- bipiridilo, 5-5’-disustituido-2, 2’-bipiridilo, 1, 10-fenantrolinilo, 4, 7-disustituido-1, 10-fenantrolinilo, 5, 6-disustituido1, 10-fenantrolinilo, o N, N’-dimetil 2, 2’-biimidazol, en el que cada sustituyente es un grupo metilo, etilo, o fenilo, y en el que los grupos R y R1 están coordinados con osmio a través de sus átomos de nitrógeno; R2 es hidrógeno, metilo,

o etilo; --L--es un enlazante; E es un enlazante trivalente; B es un grupo que comprende un ligando capaz de unirse

a una pareja de unión de analito específica; Z es cloro o bromo; X es un contraión; y y se selecciona para 10 proporcionar una sal neutra; y m es de 2 a 4.

2. El compuesto de la reivindicación 1 en el que R y R1 son los mismos y se seleccionan entre 2, 2’-bipiridilo, 4, 4’disustituido-2, 2’-bipiridilo, o 5-5’-disustituido-2, 2’-bipiridilo sustituido con un grupo metilo, etilo o fenilo.

3. El compuesto de la reivindicación 1 en el que L comprende - (CH2) nQ-, Q es O, NR3 o S en el que R3 es H, CH3 o C2H5, y n es un número entero entre 1 y 10.

4. El compuesto de la reivindicación 1 en el que L es - (CH2) nN- y n es un número entero entre 1 y 10.

5. El compuesto de la reivindicación 1 en el que E comprende un grupo aromático tridentado.

6. El compuesto de la reivindicación 1 en el que E comprende un grupo alifático tridentado con uno o más sustituyentes de oxígeno.

7. El compuesto de la reivindicación 1 en el que B comprende un epítopo reconocible por un anticuerpo capaz de 20 unirse de forma específica a un analito.

8. El compuesto de la reivindicación 1 en el que B comprende un epítopo capaz de unirse a un analito selecionado entre el grupo que consiste en: un agente de guerra biológica, una sustancia de abuso, un agente terapéutico, un contaminante ambiental, una proteína o una hormona.

9. El compuesto de la reivindicación 1 en el que X se selecciona entre el grupo de : cloruro, bromuro, yoduro, 25 fluoruro, tetrafluoroborato, perclorato, nitrato, sulfato, carbonato, y sulfito.

10. Un compuesto de fórmula III:

en el que, R y R1 son los mismos o diferentes y cada uno puede seleccionarse entre: 2, 2’-bipiridilo, 4, 4’-disustituido

2, 2’- bipiridilo, 5-5’-disustituido-2, 2’-bipiridilo, 1, 10-fenantrolinilo, 4, 7-disustituido-1, 10-fenantrolinilo, 5, 6-disustituido1, 10-fenantrolinilo, o N, N’-dimetil 2, 2’-biimidazol, en el que cada sustituyente es un grupo metilo, etilo, o fenilo, y en el que los grupos R y R1 están coordinados con Os a través de sus átomos de nitrógeno, R2 es una cadena recta o ramificada, sustituida o sin sustituir, saturada o insaturada, grupo hidrocarbilo con 1-10 átomos de carbono; -R3 es H,

CH3 o C2H5; L es (CH2) iQ en el que i es un número entero entre 1 y 10, y Q es O, S, o NR3; B es un grupo que comprende un ligando capaz de unirse a una pareja de unión de analito específica; X es un contraión; y se selecciona para proporcionar una sal neutra; y m es de 4 a 8.

11. El compuesto de la reivindicación 10 en el que R y R1 son los mismos y se seleccionan entre 2, 2’-bipiridilo, 4, 4’disustituido-2, 2’-bipiridilo, o 5-5’-disustituido-2, 2’-bipiridil sustituido con un metilo, un etilo o un grupo fenilo.

12. El compuesto de la reivindicación 10 en el que L es - (CH2) nNR3 y n es un número entero entre 1 y 10.

13. El compuesto de la reivindicación 10 en el que el sustituyente R2 es un grupo alifático saturado que tiene entre 1 y 10 carbonos.

14. El compuesto de la reivindicación 10 en el que B comprende un epítopo reconocible por un anticuerpo capaz de unirse de forma específica a un analito.

15. El compuesto de la reivindicación 10 en el que B comprende un epítopo capaz de unirse a un analito seleccionado del grupo que consiste en: un agente de guerra biológica, una sustancia de abuso, un agente terapéutico, un contaminante ambiental, una proteína o una hormona.

16. El compuesto de la reivindicación 10 en el que L es - (CH2) nS y n es un número entero entre 1 y 10.

17. El compuesto de la reivindicación 10 en el que X se selecciona de entre el grupo de: cloruro, bromuro, yoduro, 20 fluoruro, tetrafluoroborato, perclorato, nitrato, sulfato, carbonato, y sulfito.