SISTEMA DE AUTOLISIS CELULAR PARA EL PROCESADO DE LA BIOMASA BACTERIANA EN LA PRODUCCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS EN PSEUDOMONAS PUTIDA KT2440.

Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas putida KT2440.

La presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterólogo lítico donde dicho sistema a su vez comprende la secuencia nucleotídica que codifica la enzima lítica de pared celular endolisina Ejl, la secuencia nucleotídica que codifica la holina Ejh, y una secuencia nucleotídica que codifica un sistema de regulación génica, que a su vez comprende una secuencia nucleotídica promotora de la expresión génica, y una secuencia nucleotídica que codifica y expresa una proteína reguladora de dicha expresión génica. Preferiblemente la cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659. Además, la presente invención también se refiere a dicha cepa donde el microorganismo Pseudomonas putida KT2440 es mutante en uno o más de los genes tol-pal. Preferiblemente dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7658. Además, la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas descritas para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) sintetizado por dicha bacteria así como a un método para la extracción de dicho compuesto.

Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas putida KT2440.

Estado de la técnica anterior

La tecnología de los bioprocesos ha experimentado en los últimos años un avance considerable tratando de mejorar y adaptar la moderna biotecnología a las tecnologías clásicas de fermentación. En este sentido, la tecnología del DNA recombinante o, en un concepto más amplio, las técnicas de biología molecular, han sido determinantes para que se pueda explotar y manipular un gran número de organismos para la producción de compuestos de interés. En gran medida, este éxito ha sido posible gracias al desarrollo de sistemas de expresión de genes en organismos heterólogos más fáciles de manipular y multiplicar. Dentro de las diferentes opciones que se pueden estudiar, cabe destacar aquéllas que no sólo pretenden la expresión de un gen o conjunto de genes sino que, además, tratan de facilitar la obtención de un producto de interés biotecnológico y de alto valor añadido, como son los biopolímeros plásticos o bioplásticos. Sin embargo, el uso de este tipo de biopolímeros no se ha implantado hasta ahora en el mercado de forma competitiva debido al bajo coste que aún mantiene la síntesis de los polímeros plásticos derivados del petróleo (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates.In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer. 397-428) . Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso del plástico convencional y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energía y la producción de materiales de alto consumo como son los biopolímeros plásticos, y en particular los polihidroxialcanoatos (PHAs) (Gavrilescu et al. (2005) . Biotechnology Advances, 23: 471-499) .

Los PHAs, conocidos comúnmente como “bioplásticos”, son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev.,

63: 21-53; Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates.In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer, 397-428) . Estos biopolímeros son biodegradables y las bacterias los sintetizan a partir de fuentes renovables como por ejemplo la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales. Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser biodegradado en condiciones controladas y que presenta características físico-químicas similares a los plásticos derivados de la industria petroleoquímica (Sarasa et al. 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764-3768) .

En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster (93-97% del peso seco del gránulo [PSG]) rodeado por fosfolípidos (1-6% del PSG) y proteínas asociadas al gránulo (GAPs) (1-2% del PSG) , las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol., 41: 94-105) . Hasta el momento se han definido tres clases de GAPs en bacterias: i) las PHA sintasas, involucradas en la polimerización del PHA, ii) las PHA despolimerasas, responsables de la degradación del bioplástico y iii) las fasinas, las GAPs más abundantes, con una función estructural o reguladora (Prieto et al. 1999a. Appl. Environ. Microbiol., 65: 3265-3271; Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol., 70: 3205-3212) .

Los PHAs se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura química: los PHAs de cadena corta (scl-PHAs) obtenidos a partir de monómeros con 4 o 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs) procedentes de monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PHAs identificados hasta la fecha son polímeros lineales compuestos de 3-hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R (RHAs) . El peso molecular de estos polímeros varía entre 50.000-1.000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quiral (Prieto et al. (1999b) J. Bacteriol. 181: 858-868) .

Es conocido que la composición del polímero depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Durner, et al. 2001. Biotechnol. Bioeng., 72: 278-288, Jung et al. 2001. Biotechnol. Bioeng., 72: 19-24) . Por otra parte, es importante resaltar que las características físico-químicas de los polímeros varían según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21-53; Kessler et al, 2001. J. Biotechnol., 86: 97-104) . Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHAs diferentes como componentes de los PHAs producidos por bacterias (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol., 41: 94-105; Sudesh et al. 2000. Prog. Polym. Sci., 25: 1503-1555) , y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, como a su entrecruzamientoyala adición de grupos funcionales (Lageveen, R. G. et al., 1988. Appl. Environ. Microbiol., 54: 2924-2932.) , es fácil imaginar la gran diversidad de bioplásticos y RHAs diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Es importante señalar que los PHAs también pueden ser útiles para aplicaciones biomédicas como biomateriales (Zinn et al. 2001. Adv. Drug. Deliv. Rev., 53: 5-21) . Además, el PHA puede ser considerado como una fuente de nuevos compuestos quirales (sintones) de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica, ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos convencionales.

En la producción de los PHAs mediante fermentación bacteriana, el proceso de extracción de los mismos es probablemente el paso más importante desde el punto de vista del ahorro de costes de producción y del desarrollo de un proceso de fabricación respetuoso con el medio ambiente. Hasta ahora se han desarrollado diferentes métodos para extraer el PHA de las bacterias productoras pero en su mayoría requieren el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos, cócteles enzimáticos o detergentes (Elbahloul Y, Steinbüchel A, 2009. Appl Environ Microbiol., 75: 64351) .

Por otra parte, la mayoría de los bacteriófagos (o fagos abreviadamente) , con excepción de los filamentosos, son líticos y rompen la pared de la bacteria huésped hasta su lisis completa. Aunque hay más de una estrategia para llevar a cabo este proceso, la gran mayoría de los fagos se valen de dos proteínas que actúan de manera perfectamente coordinada: una holina y una endolisina. Los genes que codifican estas proteínas suelen estar contiguos y su transcripción y traducción es tardía, iniciándose sólo cuando los viriones están en su última fase de empaquetamiento dentro del citoplasma bacteriano. Las holinas constituyen un grupo de proteínas fágicas de estructura primaria muy variada pero que se agrupan en tres clases y funcionalmente son muy similares en su modo de acción. Son proteínas pequeñas, con dominios transmembranales que se localizan en la membrana citoplásmica formando un poro o agujero (“hole”) que en un momento genéticamente programado permite el paso de la enzima lítica (endolisina) encargada de romper la pared bacteriana y provocar la lisis (Wang et al. (2000) Annu. Rev. Microbiol 54: 799-825) . Las endolisinas son enzimas líticas codificadas por los fagos, no tienen péptido señal de secreción, se acumulan en el citoplasma durante el ciclo vegetativo y se translocan a la pared celular a través del poro formado por la oligomerización de la holina. Una vez en la pared celular, se unen al peptidoglicano, rompen enlaces específicos y desencadenan la lisis bacteriana y la posterior liberación de la progenie fágica. Dependiendo del tipo de enlace que hidrolicen, las endolisinas pueden ser muramidasas, glucosaminidasas, transglicosilasas, amidasas o endopeptidasas (Hermoso et al. (2007) Curr. Op. Microbiol. 10: 461-472) .

Por otra parte, el complejo Tol-Pal de las bacterias está organizado en dos complejos proteicos: un complejo de la membrana interna que consiste en las proteínas... [Seguir leyendo]

1. Cepa recombinante bacteriana Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterólogo lítico donde dicho sistema a su vez comprende las secuencias nucleotídicas que codifican: a) una enzima lítica de pared celular,

b) una holina, y c) un sistema regulador de la expresión génica.

2. Cepa según la reivindicación 1, donde: a) la enzima lítica de pared celular es la endolisina Ejl, b) la holina es la proteína Ejh, y c) el sistema regulador de la expresión génica es XylS/Pm.

3. Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659.

4. Cepa según cualquiera de las reivindicaciones1a3, donde dicha cepa de Pseudomonas putida KT2440 es mutante en uno o más de los genes tol-pal.

5. Cepa según la reivindicación 4, donde dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7658.

6. Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el sistema genético heterólogo lítico está insertado en su ADN cromosómico.

7. Cepa según la reivindicación 6, donde el sistema genético heterólogo lítico insertado en su ADN cromosómico se encuentra en una sola copia.

8. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones1a7 para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) .

9. Método para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) sintetizado por la bacteria según cualquiera de las reivindicaciones1a7, que comprende: a) cultivar dicha cepa en un medio mínimo de cultivo, b) añadir un compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico al cultivo del paso (a) ,

y c) aislar el compuesto sintetizado por dicha bacteria.

10. Método según la reivindicación 9, donde además comprende un paso previo al paso (a) donde la cepa o población bacteriana se cultiva en un medio rico de cultivo.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, donde el compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico es ácido 3-metilbenzoico.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde además, tras el paso (b) , se adiciona una sustancia química que produce lisis celular o que acelera la lisis celular mediada por el sistema genético heterólogo lítico.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde además, después del paso (a) , se adiciona un precursor de PHA.

14. Método según la reivindicación 13, donde el precursor de PHA es un ácido graso o cualquier molécula susceptible de ser transformada en hidroxialcanoil-CoA mediante el metabolismo bacteriano.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas

<120> Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en Pseudomonas putida KT2440

<130> 1641.379

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 258

<212> DNA

<213> bacteriófago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae

<400> 1

<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> bacteriófago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae

<400> 2

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> bacteriófago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae

<400> 3

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> bacteriófago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae

<400> 4

<210> 5

<211> 966

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 5

<210> 6

<211> 746

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 6