Método para producir una micromatriz que tiene una serie de rasgos que comprenden multitud de sondasoligonucleotídicas de longitud variable que tienen una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia de referenciaexcepto para una discordancia respecto a la secuencia de referencia,

comprendiendo el método las etapas de:seleccionar multitud de sondas de longitud variable para matrices de oligonucleótidos, en donde las sondasde longitud variable se obtienen introduciendo una longitud de sonda mínima, una longitud de sonda máxima y unatemperatura de fusión teórica para las sondas para matrices de oligonucleótidos en un algoritmo de selección desondas; en donde el algoritmo es capaz de calcular sondas oligonucleotídicas de longitud de variable, la Tm teóricase divide por la mitad, por lo que la longitud de cada porción de la sonda a cada lado de la discordancia se puedevariar de tal forma que permanezca dentro de los parámetros de longitud especificados para alcanzar la mitad de laTm teórica especificada, en donde todas las sondas muestran las características siguientes: (i) temperatura defusión similar y (ii) posición de discordancia en cada sonda localizada en el centro termodinámico aproximado decada sonda; y

sintetizar las sondas oligonucleotídicas inmovilizadas a un sustrato para producir la micromatriz, en donde lalongitud de las sondas se determina seleccionando la etapa de tal forma que la longitud de las sondas de algunosrasgos es diferente de la longitud de las sondas de otros rasgos.

Selección de sonda de longitud variable

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La llegada de la tecnología de micromatrices de ADN hace posible construir una matriz con cientos de miles de secuencias de ADN en una superficie muy pequeña, tal como del tamaño de un portaobjetos para microscopio. Véanse, p. ej., las patentes de los EE.UU. n.º 6 375 903 y n.º 5 143 854. La descripción de la patente de los EE.UU. n.º 6 375 903 permite la construcción de los también denominados instrumentos sintetizadores de matrices sin máscara (MAS, por su nombre en inglés) en los que se utiliza la luz para dirigir la síntesis de las secuencias de ADN, estableciéndose la dirección de la luz con un dispositivo microespejo digital (DMD) . Utilizando un instrumento MAS, la selección de secuencias de ADN que constituirán la micromatriz está controlada mediante el programa de ordenador, por lo que se pueden construir matrices a medida para cada caso según se soliciten. En general, la tecnología de síntesis de micromatrices de ADN basada en MAS permite la síntesis en paralelo de unos 800 000 oligonucleótidos únicos en una área muy pequeña de un portaobjetos para microscopio estándar. Las micromatrices se sintetizan de forma general utilizando luz para dirigir qué oligonucleótidos se sintetizan en cada posición concreta en una matriz, denominándose rasgos (features) a cada una de estas posiciones. Otra ventaja de los instrumentos de síntesis de micromatrices por MAS es que la denominación de las sondas se encuentra controlada por el programa informático. Esto permite diseñar micromatrices diseñadas a medida y utilizarlas con la máxima flexibilidad en cuanto al diseño de sondas para matrices, ya que se pueden fabricar sondas diferenciales para cada matriz, incluso para diferentes matrices cuyo objetivo sea analizar los mismos elementos genéticos.

Con la disponibilidad de los genomas enteros de cientos de organismos, para los cuales se ha depositado por lo general una secuencia de referencia en una base de datos pública, se están utilizando las micromatrices para realizar análisis de secuencias del ADN aislado de tales organismos. Una técnica que se puede utilizar para identificar una variante genética es la de secuenciar el ADN genómico de un individuo y luego comparar esta secuencia con la secuencia de referencia de dicho organismo. Se ha encontrado que muchas diferencias en la secuencia del ADN se presentan como variaciones únicas de la secuencia del ADN, que a menudo se denominan polimorfismos mononucleotídicos o SNP (por su nombre en inglés) . La comparación de las secuencias entre el genoma problema y el genoma de referencia de una especie se ha realizado con un mecanismo de fuerza bruta, la secuenciación capilar, para identificar los SNP de un individuo en concreto.

Una etapa clave y una estrategia más reciente para identificar las variaciones genéticas asociadas a las enfermedades es resecuenciar los genes candidatos u otras regiones genómicas de interés en los pacientes y en los controles para identificar los SNP asociados a un fenotipo determinado (véase Sakai et al., (1989) PNAS 86: 62306234) . Una estrategia de resecuenciación que ha demostrado tener resultados significativos utiliza la tecnología de micromatrices con oligonucleótidos (Hacia et al., (1999) Nature Genetics, 21 (1 Suppl) : 42-7) .

En particular, este tipo de estrategia de resecuenciación con matrices (ABR, por su nombre en inglés) depende de la hibridación diferencial de fragmentos genómicos sobre oligonucleótidos cortos de concordancia (coincidencia) perfecta (PM, por su nombre en inglés) y con discordancias (MM, por su nombre en inglés) . Cada nucleótido a consultar se encuentra localizado en la posición central de un oligonucleótido. Para cada oligonucleótido PM también se sintetizan en la matriz las sondas que representan los tres nucleótidos discordantes posibles, cada uno para representar cada posible SNP en la misma posición central. Las diferencias de la intensidad de las señales de hibridación entre las secuencias que se fijan fuertemente a los oligonucleótidos PM y las se que unen mal a los correspondientes oligonucleótidos MM hacen posible diferenciar la base correcta en una posición de secuencia dada. Así pues, en teoría, siempre que haya un SNP, la sonda con discordancias que representa este SNP tendrá una intensidad de señal más alta que la correspondiente sonda que concuerda con la secuencia de referencia.

Sin embargo, debido a que no somos capaces de predecir la fuerza de la señal, al variar la eficacia de hibridación, y otras diferentes fuentes de ruido, este método da lugar típicamente a muchas posiciones de bases cuyas identidades se predicen de modo incorrecto. Por ejemplo, dado que todas las sondas para matrices se deben hibridar en las mismas condiciones de temperatura y de rigor de la hibridación, pueden aparecer problemas con sondas que tienen temperaturas de fusión (Tm) que divergen significativamente de la temperatura a la que se hibrida la matriz. En el caso de las sondas con una Tm baja, las dianas hibridadas se despegarían significativamente de la superficie de la matriz, lo que produciría poca o ninguna señal. En el caso de las sondas con una Tm elevada, la discordancia de una única base podría no desestabilizarla significativamente y no proporcionaría una discriminación adecuada para que la deducción de la base fuera robusta.

Otro problema con la discriminación de una única base es que la posición de la discordancia puede alterar significativamente la capacidad que una sonda tiene para proporcionar una discriminación significativa y no permitiría que deducción de la base fuera robusta. Por ejemplo, si la Tm del trozo de la sonda a uno de los lados de la discordancia es muy alta, este trozo de sonda puede mostrar una hibridación robusta independientemente de la discordancia y, por lo tanto, la discordancia no proporcionaría suficiente discriminación para la deducción de la base. Así pues, una contribución deseable a la técnica serían las estrategias alternativas para incrementar la eficacia y la exactitud de los análisis basados en matrices, tales como la resecuenciación de ADN, para identificar mutaciones en el genoma de los organismos.

Las patentes de los EE.UU. n.º 6 468 744 y n.º 6 228 575 describen (i) el análisis de polimorfismos genéticos y del número de copias génicas y (ii) la identificación de especies mediante chips y la caracterización fenotípica de microorganismos utilizando micromatrices de oligonucleótidos, respectivamente.

Anderson et al (1995) Gene Probe: A Practical Approach, páginas 1-29 está relacionado con la estrategia de hibridación. Nuwaysir et al (2002) Genome Research, páginas 1749-1755 está relacionado con el análisis de la expresión génica mediante matrices de oligonucleótidos producidas mediante fotolitografía sin máscara.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se resume como un nuevo método para incrementar la eficacia y la exactitud del mapeo de mutaciones de alto rendimiento y de la resecuenciación de genomas mediante un algoritmo de selección de sondas de longitud variable para seleccionar racionalmente las sondas a utilizar en el diseño de matrices de oligonucleótidos. Así pues, la presente invención da a conocer un método y un algoritmo para variar de modo racional la longitud de las sondas oligonucleotídicas que permiten discriminar con exactitud las discordancias de una única base en los proyectos de resecuenciación a gran escala.

En un aspecto, la invención da a conocer un método para producir una micromatriz que tiene una serie de rasgos que comprenden una multitud de sondas oligonucleotídicas de longitud variable que tienen una discordancia nucleotídica respecto a la secuencia de referencia, y el método comprende las etapas de:

seleccionar una multitud de sondas de longitud variable para matrices de oligonucleótidos, en donde las sondas de longitud variable se deducen introduciendo una longitud de sonda mínima, una longitud de sonda máxima y una temperatura de fusión teórica para una multitud de sondas para matrices de oligonucleótidos en un algoritmo de selección de sondas; en donde el algoritmo es capaz de calcular longitudes de sondas oligonucleotídicas variables, la Tm teórica de cada sonda cuando se divide por la mitad, por lo que se puede variar la longitud de la porción de la sonda a cada lado de la discordancia de modo que permanezca dentro de los parámetros de longitud especificados para alcanzar la mitad de la Tm teórica especificada, en donde las sondas muestran... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una micromatriz que tiene una serie de rasgos que comprenden multitud de sondas oligonucleotídicas de longitud variable que tienen una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia de referencia excepto para una discordancia respecto a la secuencia de referencia, comprendiendo el método las etapas de:

seleccionar multitud de sondas de longitud variable para matrices de oligonucleótidos, en donde las sondas de longitud variable se obtienen introduciendo una longitud de sonda mínima, una longitud de sonda máxima y una temperatura de fusión teórica para las sondas para matrices de oligonucleótidos en un algoritmo de selección de sondas; en donde el algoritmo es capaz de calcular sondas oligonucleotídicas de longitud de variable, la Tm teórica se divide por la mitad, por lo que la longitud de cada porción de la sonda a cada lado de la discordancia se puede variar de tal forma que permanezca dentro de los parámetros de longitud especificados para alcanzar la mitad de la Tm teórica especificada, en donde todas las sondas muestran las características siguientes: (i) temperatura de fusión similar y (ii) posición de discordancia en cada sonda localizada en el centro termodinámico aproximado de cada sonda; y

sintetizar las sondas oligonucleotídicas inmovilizadas a un sustrato para producir la micromatriz, en donde la longitud de las sondas se determina seleccionando la etapa de tal forma que la longitud de las sondas de algunos rasgos es diferente de la longitud de las sondas de otros rasgos.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la temperatura de fusión (Tm) teórica se consigue al incrementar la longitud de las sondas que tienen una Tm baja y al disminuir la longitud de las sondas que tienen una Tm alta respecto a una Tm media de las sondas.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la Tm teórica para cada una de la multitud de sondas para matrices se divide por la mitad, y cada mitad de sonda a cada lado de la posición de la discordancia varía su longitud de forma independiente, de tal forma que permanece dentro de los parámetros de longitud máxima y mínima de la sonda y alcanza la mitad de la Tm teórica.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, en el que la Tm de la sonda se calcula con la fórmula: Tm = 5 * (Gn + Cn) + 1 * (An + Tn) , donde la n es el número de cada base específica presente en la sonda.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la multitud de sondas de longitud variable para matrices de oligonucleótidos se utiliza en la resecuenciación de genomas basada en matrices.

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la síntesis de la micromatriz se realiza en un instrumento de síntesis de matrices sin máscara.