Una combinacion de reactivos polinucleotidicos que comprenden un primero,

un segundo y un tercerpolinucleotido, en el que el primer polinucleotido consiste en un polinucleotido seleccionado del grupo constituido porlas SEC ID No 1, 13 y 14, el segundo polinucleotido consiste en un polinucleotido seleccionado del grupo constituidopor las SEC ID No 2 y 15 y el tercer polinucleotido consiste en la SEC ID No 3.

Secuencias de cebador y sonda para detectar Chlamydia trachomatis

5 Campo de la invención

La invención está dirigida a composiciones y a procedimientos para la detección de plásmidos de Chlamydia trachomatis. Incluida una variante de deleción observada recientemente en sujetos en Suecia.

Antecedentes de la invención

Chlamydia trachomatis (C. trachomatis o CT) es un agente causante de enfermedades de transmisión sexual habituales, incluidos linfogranuloma venéreo, varias enfermedades inflamatorias de los sistemas urogenitales del hombre y la mujer, y tracoma, una enfermedad crónica que afecta a 500 millones de personas y que puede producir

ceguera. Cuando no se diagnostica a tiempo y se trata, la uretritis y la cervicitis inducida por CT pueden llevar a inflamaciones crónicas, por ejemplo, vaginitis, salpingitis e inflamación pélvica, que pueden tener como resultado esterilidad y embarazo extrauterino. Además, los recién nacidos de madres infectadas pueden contraer infecciones pulmonares y/u oculares durante el parto.

Las Clamidias

Chlamydiae son procariotas que exhiben similitudes morfológicas y estructurales con las bacterias gramnegativas, incluida una membrana externa trilaminar que contiene lipopolisacárido y varias proteínas de membrana. Chlamydiae difiere de otras bacterias en su morfología y en que tiene un ciclo de desarrollo único. Parásitos

intracelulares obligados, Chlamydiae tiene un ciclo de vida bifásico único que consiste en una etapa extracelular metabólicamente inactiva pero infecciosa y una etapa intracelular replicante pero no infecciosa. La etapa de replicación del ciclo de vida tiene lugar dentro de una inclusión unida a la membrana que secuestra las bacterias y las aleja del citoplasma de la célula huésped infectada.

Se han aislado muchas cepas diferentes de Chlamydiae de mamíferos (incluido el ser humano) y aves. Las cepas se pueden distinguir en base a la gama de huéspedes, la virulencia, la patogenia y la composición antigénica. Existe una fuerte identidad de secuencia del ADN dentro de cada especie, pero, sorprendentemente poco entre especies, lo que sugiere una separación prolongada en la evolución.

En casi todos los aislamientos de CT se encuentra un plásmido críptico (ADN extracromosómico) de aproximadamente 7501 pb y que tiene una función desconocida y se conoce en, por ejemplo, la cepa LGV como “pLGV440." El plásmido no es esencial para la supervivencia de CT, pero cabe destacar que la secuencia está altamente conservada en los aislamientos (p. ej., véase (Comanducci y col., 1990) ) .

Pruebas diagnósticas

Los ensayos diagnósticos específicos y rápidos son de suma importancia para el éxito de la intervención contra CT. El diagnóstico basado en el crecimiento selectivo de las bacterias patogénicas ha sido el patrón, pero el cultivo de células consume mucho tiempo. El cultivo in vitro de muchos aislamientos clínicos es difícil. Dado que la infección

45 bacteriana con bacterias tiene como resultado la formación de anticuerpos en el huésped, también se ha usado el suero de pacientes con infecciones del tracto genital para diagnosticar la infección por CT. Sin embargo, los ensayos basados en marcadores serológicos son no cuantitativos y a menudo difíciles de interpretar. Por ejemplo, los títulos de anticuerpos pueden ser indetectables en infecciones agudas (un resultado falso negativo) , pueden persistir en individuos no infectados con antecedentes de infección (un resultado falso positivo) , pueden producir un falso positivo debido a la presencia de especies que interaccionan de manera cruzada (por ejemplo, infección respiratoria causada por diferentes especies de Clamidia) o pueden no desarrollarse en absoluto (un resultado falso negativo) dependiendo de otros factores Black y col., 1991, Ngeow, 1996) . Por estas razones, la serología sola no es adecuada para el diagnóstico de las infecciones por CT.

55 Se han producido intentos de remediar estas faltas de idoneidad. Por ejemplo, los productos de los laboratorios Abbott REALTIMETM CT/NG (2G28) y CT (1 L31) usan cebadores y sondas para reacción en cadena de la polimerasa del plásmido críptico de Clamidia en un formato homogéneo en tiempo real (Pabich y col., 2004) . Jalal y col. (Jalal et al., 2006) desarrollaron un gen rotor, ensato de PCR en tiempo real para detectar, identificar y cuantificar CT e una única reacción. Picket y col. (Pickett et al., 2005) pudieron determinar con exactitud el número de copias de CT y C. pneumoniae (N16) usando también PCR en tiempo real.

Nuevos retos en la detección de CT

Los procedimientos basados en PCR de detección de CT han minado las ventajas del plásmido críptico encontrado

65 en casi todas las cepas de CT. El plásmido se ve favorecido como diana para un diagnóstico basado en polinucleótidos de la infección por CT porque, por bacteria, hay aproximadamente 4-10 copias del plásmido Jalal y

col., 2006; Palmer and Falkow, 1986; Pickett y col., 2005; Tam y col., 1992) .

No obstante, en Suecia se ha detectado una nueva variante de CT con una deleción en el plásmido (“CTSW”) tras una inesperada disminución del 25 % de las infecciones por CT observada en Halland county, Suecia (Ripa y 5 Nilsson, 2006) .

Durante la última década, los laboratorios de Suecia han usado pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) usando el plásmido críptico como molde para la amplificación del ADN para diagnosticar las infecciones por CT.

Desde mediados de septiembre a octubre de 2006, el laboratorio de microbiología del condado en Halmstad, Halland county, analizó 1.700 muestras entrantes consecutivas con una PCR específica de la proteína principal de la membrana externa (MOMP) en paralelo con la PCR del plásmido m2000 de Abbott. En el 13 % de todos los casos de CT diagnosticados en Halland county durante este periodo, Ripa y col. encontraron una cepa variante que solo dio positivo e las pruebas MOMP. Los datos clínicos indican ausencia de diferencia con respecto a las infecciones

con las cepas de tipo salvaje. La cepa parece estar extendida por Suecia, Aunque la prevalencia en estas áreas todavía es desconocida.

Se secuenció la parte del plásmido de la cepa variante. Ripa y col. encontraron una deleción de 377 pares de bases en el área diana para las pruebas NAAT para CT fabricadas por Abbott y Roche (nucleótidos 654 a 1030 de Nº de Acceso X06707; SEC ID Nº 4) . Ahora SE han secuenciado dos cepas variantes y se ha encontrado que tienen la misma deleción (Ripa y Nilsson, 2006) . Por tanto, en la técnica existe la necesidad de nuevas pruebas NAAT que sean capaces de detectar esta cepa variante, así como distinguir esta cepa variante de otras cepas de CT.

Sumario de la invención

Varios aspectos de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas y se divulgan a continuación en el presente documento. E un primer aspecto, la presente invención proporciona una combinación de reactivos polinucleotídicos que comprenden un primero, un segundo y un tercer polinucleótido, en el que el primer polinucleótido consiste en un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 1, 13 y 14, el segundo polinucleótido consiste en un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 2 y 15 y el tercer polinucleótido consiste en la SEC ID Nº 3.

La invención también hace referencia a un segundo aspecto, en el que la combinación de los reactivos polinucleotídicos del primer aspecto comprende además un cuarto, quinto y sexto polinucleótidos, en los que la

combinación es útil para detectar y/o amplificar CT y CTSW. En esta combinación de reactivos polinucleotídicos, el cuarto polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 100% con un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 28-30 y sus complementarias; el quinto polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 100% con un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por la SEC ID Nº 31 y una complementaria de la misma; y el sexto polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad... [Seguir leyendo]

1. Una combinación de reactivos polinucleotídicos que comprenden un primero, un segundo y un tercer polinucleótido, en el que el primer polinucleótido consiste en un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por

las SEC ID Nº 1, 13 y 14, el segundo polinucleótido consiste en un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 2 y 15 y el tercer polinucleótido consiste en la SEC ID Nº 3.

2. La combinación de los reactivos polinucleotídicos de la reivindicación 1, en la que al menos un reactivo

polinucleotídico comprende un marcador detectable. 10

3. La combinación de reactivos polinucleotídicos de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un cuarto, un quinto y un sexto polinucleótido, en el que el cuarto polinucleótido consiste en una secuencia de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos 70 % con un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID N.

2. 30 y una complementaria de la misma; el quinto polinucleótido consiste en una

secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº 31 y una complementaria de la misma; y el sexto polinucleótido consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID N.

3. 34 y sus complementarias.

4. La combinación de los reactivos polinucleotídicos de la reivindicación 3, en la que al menos un reactivo polinucleotídico comprende un marcador detectable.

5. La combinación de los reactivos polinucleotídicos de la reivindicación 3, en la que al menos un reactivo

polinucleotídico comprende además un inactivador. 25

6. La combinación de los reactivos polinucleotídicos de la reivindicación 1, en la que el tercer polinucleótido comprende un marcador y un inactivador.

7. Un kit que comprende la combinación de reactivos polinucleotídicos de la reivindicación 1 y reactivos de 30 amplificación.

8. Un procedimiento de amplificar una secuencia de ácido nucleico de Chlamydia trachomatis en una muestra, que comprende

(a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación, una muestra de la que se sospecha que contiene una secuencia de ácido nucleico de Chlamydia trachomatis y la combinación del primero y el Segundo polinucleótidos de la reivindicación 1; y

(b) someter la mezcla a las condiciones de estimular los reactivos de amplificación para amplificar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria al tercer polinucleótido de la reivindicación

1.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la mezcla de reacción comprende además un polinucleótido diana control y una sonda polinucleotídica control.

45 10. Un procedimiento de detectar Chlamydia trachomatis en una muestra, que comprende

(a) formar una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación, una muestra de la que se sospecha que contiene una secuencia de ácido nucleico de Chlamydia trachomatis y la combinación del primero y el Segundo polinucleótidos de la reivindicación 1; y

50 (b) someter la mezcla a las condiciones de estimular los reactivos de amplificación para amplificar al menos una copia de una secuencia de ácido nucleico complementaria al tercer polinucleótido de la reivindicación 1;

(c) someter la mezcla a las condiciones que estimulen la hibridación específica del tercer reactivo

polinucleotídico a una secuencia diana; y 55 (d) detectar híbridos del tercer polinucleótido:secuencia diana.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la mezcla de reacción comprende además un polinucleótido diana control y una sonda polinucleotídica control.