SECUENCIA DE ADN Y PREPARACIÓN RECOMBINANTE DE ALÉRGENO DEL POLEN DE GRAMÍNEAS LOL P 4.

Una molécula de ADN que codifica para un alérgeno con las propiedades de Lol p 4,

correspondiente a una secuencia de nucleótidos seleccionada entre una de las secuencias según SEC ID Nº 1 y 3.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2004/013663.

Solicitante: MERCK PATENT GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: FRANKFURTER STRASSE 250 64293 DARMSTADT ALEMANIA.

Inventor/es: FIEBIG, HELMUT, CROMWELL, OLIVER, NANDY,ANDREAS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
  • C12N15/29 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas vegetales, p. ej. taumatina.

PDF original: ES-2375618_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Secuencia de ADN y preparación recombinante del alérgeno del polen de gramíneas lol p 4

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a la preparación de una secuencia de ADN del alérgeno mayor de polen de gramíneas Lol p 4. La invención incluye también fragmentos y nuevas combinaciones de secuencias parciales. Las moléculas de ADN recombinante y los polipéptidos derivados, fragmentos y nuevas combinaciones de secuencias parciales se pueden utilizar para la terapia de enfermedades de alergia al polen. Las proteínas recombinantes preparadas se pueden emplear para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos) , que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001) .

Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción a través de las mucosas estos alérgenos reaccionan con las moléculas IgE que están unidas a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.

Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.

Para el ballico (Lolium perenne) se identificó Lol p 1 como un alérgeno mayor (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. 78:1190-1201) y se resolvió su estructura primaria (Perez y col., 1990, J. Biol. Chem. 265:16210-16215) . Otro alérgeno mayor es Lol p 2 (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. 78:1190-1201) cuya estructura primaria se describió en 1993 (Ansari y col., 1989, J. Biol. Chem.: 264:11181-11185) . Otro alérgeno mayor del ballico es Lol p 5 (Mattiesen y Löwenstein 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307) . La estructura primaria de Lol p 5 también es conocida (Ong y col., 1993, Gene 134:235-240) .

El ballico contiene además los alérgenos mayores de los grupos 4 (Fahlbusch y col. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799807) y 13 (Petersen y col., 2001, J. Allergy Clin. Imm. 107:856-862) .

Lol p 4 es una glicoproteína típica básica (Jaggi y col, 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:342-348, Jaggi y col., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83:845-852) y en lo referente a la actividad cruzada con anticuerpos IgE específicos se compara con las bien conocidas Phl p 4, Cyn d 4 y Dac g 4 (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78:260-268; Su y col., 1991, Clin. Exp. Allergy 21:449-455; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; 14-17) .

Estas moléculas homólogas de Poaceae forman el grupo 4 de alérgenos, cuyas moléculas presentan entre sí una alta reactividad inmunológica cruzada, tanto con anticuerpos monoclonales de ratón como con anticuerpos IgE humanos (Fahlbusch y col., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic y col., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6) :361-367; Stumvoll y col. 2002, Biol. Chem. 383:1383-1396; Grote y col., 2002, Biol. Chem. 383:1441-1445; Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1) :43-51) .

Al contrario de los alérgenos mayores mencionados previamente Lol p 1, Lol p 2, Lol p 5 de Lolium perenne, la estructura primaria de Lol p 4 aún no está resuelta.

De los alérgenos del grupo 4 de Dactylus glomerata hasta ahora solamente se han obtenido por degradación enzimática y se han secuenciado los péptidos:

DIYNYMEPYVSK (SEC ID Nº 7) , VDPTDYFGNEQ (SEC ID Nº 8) , ARTAWVDSGAQLGELSY (SEC ID Nº 9) , 2 5

y GVLFNIQYVNYWFAP (SEC ID Nº 10, Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072) .

También se han obtenido por proteólisis y se han secuenciado péptidos de los alérgenos del grupo 4 de la gramínea subtropical Bermuda (Cynodon dactylon) : KTVKPLYIITP (SEC ID Nº 11) , KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (SEC ID Nº 12) , TVKPLYIITPITAAMI (SEC ID Nº 13) , LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (SEC ID Nº 14) , KWQTVAPALPDPNM (SEC ID Nº 15) , VTWIESVPYIPMGDK (SEC ID Nº 16) , GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (SEC ID Nº 17) , TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (SEC ID Nº 18) , YRDLDLGVNQVVG (SEC ID Nº 19) , SATPPTHRSGVLFNI (SEC ID Nº 20) , y AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (SEC ID Nº 21, Liaw y col., 2001, Biochem. Biophys. Research

Communication 280: 738-743) . Para Lolium perenne se describieron fragmentos de péptidos de alérgenos básicos del grupo 4 con las secuencias siguientes: FLEPVLGLIFPAGV (SEC ID Nº 22) y GLIEFPAGV (SEC ID Nº 23, Jaggi y col., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348) . Sin embargo, estas secuencias peptídicas descritas para Lolium perenne y otros alérgenos del grupo 4 no han conducido hasta ahora a la resolución de la estructura primaria del alérgeno Lol p 4. Como primera secuencia de un alérgeno del grupo 4 se ha resuelto por parte del inventor de la presente solicitud de patente la secuencia aún no publicada de Phl p 4 de Phleum pratense y se ha descrito en la solicitud internacional WO 04/000881. El objetivo en el que se basa la presente invención consiste por tanto en la preparación de una secuencia de ADN del gen Lol p 4 que codifica para un alérgeno con las propiedades inmunológicas de Lol p 4, así como un ADN recombinante correspondiente, sobre cuya base el alérgeno se exprese como proteína y se pueda hacer disponible un uso farmacológico significativo como tal o en forma modificada. La secuencia de Phl p 4 fue el punto de partida para la presente invención.

Índice de secuencias según la invención -Secuencia de ADN del gen Lol p 4 (SEC ID Nº 1) .

- Secuencia de proteína (SEC ID Nº 2) derivada de la secuencia de ADN según SEC ID Nº 1.

- Secuencia de ADN (SEC ID Nº 3) , compuesta por los nucleótidos 1-200 de Phl p 4 (según SEC ID Nº 5) , 201-1472 de Lol p 4 (según SEC ID Nº 1) así como 1473-1503 de Phl p 4 (según SEC ID Nº 5) .

- Secuencia de proteínas (SEC ID Nº 4) , compuesta por los aminoácidos 1-67 de Phl p 4 (según SEC ID Nº 6) , 68-490 de Lol p 4 (según SEC ID Nº 2) así como 491-500 de Phl p 4 (según SEC ID Nº 6) con las propiedades, en particular las propiedades inmunológicas de Lol p 4, codificada por la secuencia de ADN según SEC ID Nº 3.

- Secuencia de ADN de Phl p 4 (SEC ID Nº 5) según SEC ID Nº 5 del documento WO 04/000881.

- Secuencia de proteínas de Phl p 4 (SEC ID Nº 6) según SEC ID Nº 6 del documento WO 04/000881.

Descripción de la invención Con la presente invención se proporciona por primera vez una secuencia de ADN del alérgeno mayor del polen de gramíneas Lol p 4 (SEC ID Nº 1) que codifica para un alérgeno con las propiedades inmunológicas de Lol p 4.

Por consiguiente, es objeto de la presente invención una molécula de ADN que codifica para un alérgeno con las propiedades de Lol p 4, correspondiente a una secuencia de nucleótidos según SEC ID Nº 1.

Además, es objeto de la invención una molécula de ADN que codifica para un alérgeno con las propiedades de Lol p 4, correspondiente a una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 3, compuesto por los nucleótidos 1-201 de Phl p 4 (según SEC ID Nº 5) , 202-1470 de Lol p 4 (según SEC ID Nº 1) así como 1471-1500 de Phl p 4.

Con el conocimiento de la secuencia de ADN de los alérgenos que existen en la naturaleza ahora sólo es posible preparar estos alérgenos como proteínas recombinantes, que se pueden emplear en el diagnóstico y la terapia de enfermedades alérgicas (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391) .

La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una molécula de ADN que codifica para un alérgeno con las propiedades de Lol p 4, correspondiente a una secuencia de nucleótidos seleccionada entre una de las secuencias según SEC ID Nº 1 y 3.

2. Una molécula de ADN, correspondiente a una secuencia parcial de la molécula de ADN según la reivindicación 1, la cual codifica para un fragmento de Lol p 4 inmunomodulador, reactivo frente a células T.

3. Una molécula de ADN, correspondiente a una combinación de secuencias parciales de la molécula de ADN según la reivindicación 1, la cual codifica para un fragmento de Lol p 4 inmunomodulador, reactivo frente a células T.

4. Una molécula de ADN, correspondiente a una secuencia de nucleótidos según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizada porque una mutación conduce al intercambio de una, varias o todas las cisteínas del polipéptido correspondiente por otro aminoácido.

5. Un vector de expresión de ADN recombinante o un sistema de clonación que contiene una molécula de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4, unido funcionalmente con una secuencia control de expresión.

6. Un organismo huésped, transformado con una molécula de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4 o un vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido, codificado mediante una secuencia de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4, mediante cultivo de un organismo huésped según la reivindicación 6 y obtención del correspondiente polipéptido a partir del cultivo.

8. Un polipéptido recombinante que codifica para una secuencia de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

9. Un polipéptido según la reivindicación 8 como medicamento.

10. Una preparación farmacéutica que contiene al menos un polipéptido según la reivindicación 9 y dado el caso otros principios activos y/o coadyuvantes para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae.

11. Uso de al menos un polipéptido según la reivindicación 9 para la preparación de un medicamento para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.

12. Una molécula de ADN según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4 como medicamento.

 

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