RETROTRANSCRIPTASA DEL VIH-1 DE GRUPO O MODIFICADA.
Retrotranscriptasa del VIH-1 de grupo O modificada.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología.
Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas en la posición 75 y/o en la posición 478, que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930166.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: MENENDEZ ARIAS,LUIS, MATAMOROS GRANDE,TANIA, ALVAREZ GARCIA,MA. DEL MAR.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/12 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2358824_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Retrotranscriptasa del VIH-1 de grupo O modificada.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas.
Estado de la técnica anterior
La enzima responsable de la replicación del genoma de los retrovirus se denomina retrotranscriptasa (RT) (o transcriptasa inversa). Esta enzima convierte el ARN genómico monocatenario en ADN bicatenario capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora [revisado por Telesnitsky y Goff. En Retroviruses. Coffin et al. (ed.), p. 121-160, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview EE.UU., 1997], Se trata de una polimerasa capaz de sintetizar ADN, utilizando como molde ARN ó ADN, indistintamente. Además, la RT posee actividad endonucleasa (RNasa H), que le permite degradar el molde ARN durante el proceso de síntesis de ADN dependiente de ARN.
Por tanto, las RTs de retrovirus son enzimas útiles para la obtención de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero, que una vez amplificado por técnicas convencionales [reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo] puede utilizarse para detectar expresión génica en organismos o tejidos. A partir de librerías de ADNc es posible seleccionar transcritos de genes que una vez amplificados por PCR pueden ser clonados en plásmidos o vectores virales. Para estas aplicaciones resulta interesante disponer de RTs que presenten una mayor estabilidad térmica, es decir, que retengan actividad polimerasa a temperaturas relativamente elevadas, ya que en estas condiciones disminuirían los niveles de estructura secundaria en el ARN y mejoraría el proceso de amplificación. Por otro lado, las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa y por tanto, son polimerasas con una tasa de error relativamente alta, por lo que un aumento de su fidelidad sería deseable si lo que se pretende es clonar los productos derivados del ADNc generado durante la retrotranscripción.
Se han aislado y purificado RTs de diversos retrovirus. Entre ellas podemos citar, las del virus de mieloblastosis de aves (AMV), del virus Moloney de la leucemia de ratón (MLV) (Coté y Roth. Virus Res 2008; 134: 186-202), del virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), del virus de la inmunodeficiencia de felinos (FIV), del virus de la inmunodeficiencia de bóvidos (BIV), del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), del virus de la leucemia de bóvidos (BLV), y de espuma-retrovirus (revisado en Hizi y Herschhorn. Virus Res 2008; 134: 203-220); además de las RTs de virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2) y de la inmunodeficiencia de simios (SIV).
Desde un punto de vista metodológico las RTs más utilizadas comercialmente en reacciones de amplificación son las de MLV, AMV y VIH-1. En el caso de la RT del VIH-1, la enzima de referencia en este tipo de análisis es una variante "wild-type", que se clasifica filogenéticamente como perteneciente a subtipo B (grupo M). La RT del VIH-1 (subtipo B) es más estable que la RT del MLV a temperaturas superiores a 45ºC.
La expansión de la epidemia del SIDA y la caracterización de aislados virales del VIH en diferentes partes del mundo ha permitido constatar su gran heterogeneidad y ha conducido a la identificación de variantes de la RT alejadas filogenéticamente de la RT del VIH-1 de subtipo B. Entre ellas, las más alejadas son las pertenecientes al grupo O, que se caracterizan por presentar alrededor de un 20% de aminoácidos distintos cuando se comparan con secuencias prototipo "wild-type" de subtipo B (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373). Las RTs "wild-type" de grupo O son resistentes naturales a nevirapina y otros inhibidores no análogos a nucleósido y presentan mayor estabilidad en presencia de urea que las RTs de subtipo B (Menéndez-Arias et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27470-27479). Sin embargo, su expresión y purificación es difícil debido al escaso rendimiento de los procedimientos descritos hasta la fecha.
La caracterización de RTs obtenidas mediante mutagénesis dirigida ha permitido estudiar el papel de distintos cambios de aminoácido sobre la fidelidad de copia, así como la inactivación de la actividad RNasa H de la RT del VIH-1 (subtipo B). Sin embargo, el contexto de la secuencia ha demostrado ser de gran importancia (Taube et al. Eur. J. Biochem. 1997; 250: 106-114), por lo que no parece probable que una mutación analizada en la RT del VIH-1 subtipo B pueda ejercer el mismo efecto en una variante del VIH-1 filogenéticamente alejada como la RT del VIH-1 de grupo O.
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a retrotranscriptasas (RTs) aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas RTs.
Las RTs de retrovirus son enzimas útiles, por ejemplo, para la obtención de ADN complementario a partir de ARN mensajero, que una vez amplificado puede ser clonado en un vector. Es deseable que las RTs que se utilicen con este fin presenten elevada estabilidad térmica, ya que en estas condiciones disminuirían los niveles de estructura secundaria en el ARN y mejoraría el proceso de amplificación. Sin embargo, las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa correctora de errores y por tanto, tienen una tasa de error relativamente alta, por lo que un aumento de su fidelidad sería deseable para poder ser empleadas con este fin.
En los ejemplos de la presente invención se describen mutantes de una RT aislada de un VIH-1 de grupo O (RT del VIH-1 de grupo O) cuya subunidad p66 ha sido modificada mediante la sustitución de la valina 75 por isoleucina (mutación V75I), de manera que se observa un incremento en su fidelidad de copia con respecto a la de la RT no modificada. Es importante tener en cuenta que las RTs del VIH-1 de grupo O portadoras de esta mutación presentan mayor fidelidad de copia y termoestabilidad que las RTs presentes en aislados o cepas del VIH-1 de grupo M subtipo B (RT del VIH-1 de subtipo B), empleadas actualmente con el mismo fin.
Sin embargo, la mutación V75I en la RT del VIH-1 de grupo O conduce a una pérdida de termoestabilidad con respecto a la RT no modificada. En los ejemplos de la presente invención se demuestra como la introducción de un segundo cambio de aminoácido (mutación) consistente en la sustitución del ácido glutámico de la posición 478 de la subunidad p66 por glutamina permite aumentar su termoestabilidad con respecto a la RT que únicamente presenta la mutación V75I. Por tanto, la presente invención, proporciona RTs con elevada termoestabilidad y fidelidad de copia, apropiadas para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación que modifica dicha secuencia de aminoácidos en el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1, en el que la RT modificada tiene una fidelidad de copia incrementada, con relación a la RT no modificada correspondiente.
Preferiblemente, dicha RT comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación de manera que el residuo que se corresponde con la posición 75 de la SEQ ID NO: 1 de esta secuencia de aminoácidos es isoleucina o una sustitución conservativa de isoleucina. Se entiende por sustitución conservativa de isoleucina aquella sustitución de isoleucina por otro aminoácido que presenta similares propiedades y permite la conservación de la función de la proteína que contiene dicha sustitución. Estas sustituciones conservativas, conocidas en el estado de la técnica, son sustituciones de isoleucina por leucina o metionina.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una RT del VIH-1 de grupo O modificada, que comprende una secuencia de aminoácidos, mutada según se ha descrito anteriormente, y que además... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Retrotranscriptasa aislada de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo O y modificada para que comprenda una secuencia de aminoácidos en la que el residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por una isoleucina o por otro aminoácido que suponga una sustitución conservativa respecto a la isoleucina, donde dicha retrotranscriptasa modificada tiene una fidelidad de copia incrementada con relación a la retrotranscriptasa no modificada correspondiente.
2. Retrotranscriptasa según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 90% con la SEQ ID NO: 1.
3. Retrotranscriptasa según la reivindicación 2, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 95% con la SEQ ID NO: 1.
4. Retrotranscriptasa según la reivindicación 3, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 98% con la SEQ ID NO: 1.
5. Retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos además tiene otra sustitución del residuo que corresponde a la posición 478 de la SEQ ID NO: 1 por una glutamina o por otro aminoácido que suponga una sustitución conservativa respecto a la glutamina, y donde dicha retrotranscriptasa modificada tiene una termoestabilidad incrementada con relación a la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Retrotranscriptasa según las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 2.
7. Retrotranscriptasa según la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 3.
8. Polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 8.
10. Vector según la reivindicación 9 donde el polinucleótido está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende:
11. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 donde el polinucleótido está unido en fase de lectura a una secuencia que codifica para una etiqueta de purificación.
12. Vector según la reivindicación 11 donde la etiqueta de purificación consiste en una cola de residuos de histidina.
13. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que además comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1.
14. Célula que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y que además comprende otro vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 entre los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1.
15. Célula que comprende el vector según la reivindicación 13.
16. Método para producir la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:
17. Método para producir la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende:
18. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la retrotranscripción de un ácido nucleico molde.
19. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la amplificación de un ácido nucleico molde.
20. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la secuenciación de un ácido nucleico molde.
21. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde el ácido nucleico molde es ARNm.
22. Método de retrotranscripción de un ácido nucleico molde que comprende:
23. Método de amplificación de un ácido nucleico molde que comprende:
24. Método de secuenciación de un ácido nucleico molde que comprende:
25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 donde el ácido nucleico molde es ARNm.
26. Kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 que comprende:
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