Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo queconsiste en:

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia polinucleotídica expuesta en SEC ID Nº: 1 o su complemento;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SECID Nº: 2;

(c) la secuencia polinucleotídica que se hibrida a (a) o (b) en condiciones de rigurosidad moderada enaproximadamente el 50% de formamida, SSC 6X a aproximadamente 42 ºC y condiciones de lavado deaproximadamente 60 ºC, SSC 0,5X, SDS al 0,1 % y en el que el polipéptido codificado comprende un extremoC que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 y en el que el polipéptido es capaz deunirse a miostatina, activina A o GDF-11; y

(d) la secuencia polinucleotídica que se hibrida a (a) o (b) en condiciones de rigurosidad moderada enaproximadamente el 50% de formamida, SSC 6X a aproximadamente 42 ºC y condiciones de lavado deaproximadamente 60 ºC, SSC 0,5X, SDS al 0,1 % y en el que el polipéptido codificado comprende un extremoC que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80% idéntica a SEC ID Nº: 3 y en el que el polipéptidoes capaz de unirse a miostatina, activina A o GDF-11.

Receptor de activina novedoso y usos del mismo

5 Campo técnico de la invención

El campo técnico de la presente invención se refiere a miembros de la familia del factor 13 del crecimiento transformante (TGF-¡3) y receptores de TGF-¡3, así como también a métodos para modular las actividades de los miembros de la familia de TGF-¡3 para el tratamiento de diversos trastornos.

Antecedentes de la invención

La familia de proteínas del factor 13 del crecimiento transformante (TGF-¡3) incluye los factores 13 de crecimiento transformante (TGF-¡3) , activinas, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) , factores del crecimiento nervioso (NGF) , 15 factor neurotrófico obtenido del cerebro (BDNF) y factores de crecimiento/diferenciación (GDF) . Estos miembros de la familia están implicados en la regulación de una amplia diversidad de procesos biológicos incluyendo proliferación y diferenciación celular y otras funciones. Las activinas se descubrieron originalmente como péptidos gonadales implicados en la regulación de la síntesis de la hormona folículo estimulante y ahora se cree que están implicadas en la regulación de varias actividades biológicas incluyendo el control de sección y expresión de hormonas de la 20 pituitaria anterior tales como FSH, GH y ACTH, supervivencia de neuronas, secreción de oxitocina hipotalámica, eritroproyesis, esteroidogénesis placentaria y gonadal, desarrollo embrionario temprano y proliferación de algunos tipos de tumores. Las activinas A, By AB son los homodímeros y heterodímeros respectivamente de dos cadenas polipeptidicas, ~A y ~B (Vale el al. Nature 321, 776-779 (1986) , Ling el al., Nature 321, 779-782 (1986) ) . Las dos cadenas 13 también se pueden dimerizar con una cadena relacionada dando origen a las inhibinas A y B

respectivamente (Masan el al, Nature 318, 659-663 (1986) ) . Se ha establecido bien que las inhibinas son necesarias para mantener la función normal en muchos tejidos, particularmente aquellos asociados con funciones reproductoras. En estos tejidos las inhibinas se oponen a muchas, pero no a todas, las actividades de activina.

El factor de crecimiento/diferenciación 8 (GDF-8) , también denominado miostatina, es un miembro de la familia de 30 TGF-13 expresado en su mayoría en las células de tejido muscular esquelético en desarrollo y adulto. La miostatina parece jugar un papel esencial (McPherron el al. Nature (Londres) 387, 83-90 (1997) ) . Las miostatinas antagonizantes han demostrado aumentar la masa muscular magra en animales (McPherron et al, mencionado anteriormente, Zimmers el al, Science 296: 1486 (2002) ) .

Otro miembro de la familia de proteínas de TGF-13 es un factor del crecimiento/diferenciación relacionado, GDF-11. GDF-11 tiene una identidad de aproximadamente el 90% de la secuencia de aminoácidos de miostatina. GDF-11

tiene un papel en la formación de patrón axial en animales en desarrollo (Oh el al, Genes Dev 11: 1812-26 (1997) ) Y

también parece jugar un papel en el desarrollo y crecimiento del músculo esquelético. Sin embargo, el papel posnatal de G DF-11 no se comprende actualmente.

Una familia de serina/treonina quinasas transmembrana se conoce que actúa como receptores de activinas y otros miembros de la familia de TGF-I3. Estos receptores caen en dos subfamilias diferentes conocidas como receptores de tipo I y tipo II que actúan cooperativamente para unir ligando y transducir señal (Attisano et al., Mol Cell Biol 16

(3) , 1066-1073 (1996) ) . La mayoria de los ligandos de TGF-~ se cree que se unen en primer lugar a un receptor de 45 tipo II y este complejo de ligandolreceptor de tipo II después recluta un receptor de tipo I (Mathews, LS, Endocr Rev 15:310-325 (1994) ; Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000) ) . La quinasa receptora de tipo II

después fosforila y activa a la quinasa receptora de tipo 1, la cual a su vez fosforila las proteínas Smad. Las activinas inicialmente se unen a sus receptores de tipo 11 ActRllA para activina A o ActRllB para activina B. Esto está seguido por el reclutamiento, la fosforilación y la posterior activación del receptor de tipo 1, quinasa 4 similar a activina 50 (ALK4) . A la activación, la ALK4 se une y después fosforila un subgrupo de proteinas Smad citoplasmáticas (Smad2 y Smad3) que producen la transducción de señal para aclivinas (Der y nck, R el al. Ce1l95, 737-740 (1998) ) .

Estudios de entrecruzamiento han determinado que la miostatina es capaz de unirse a los receptores de tipo II de aclivina ActRllA y ActRllB in vi/ro (Lee el al. PNAS EE.UU. 98: 9306-11 (2001) ) . También existe evidencia de que 55 GDF-11 se une tanto a ActRIIA como AclRllB (Oh el al., Genes Dev 16: 2749-54 (2002) ) .

Las proteínas de TGF-13 se conoce que están asociadas con una diversidad de patologías y la antagonización de estas proteínas puede ser útil como un tratamiento terapéutico para las patologías. En particular la antagonización de varias proteínas de TGF-13 simultáneamente puede ser particularmente eficaz para tratar determinadas 60 enfermedades. La presente invención proporciona una composición novedosa de materia y métodos de uso de la composición de materia como un tratamiento para trastornos relacionados con músculo y otros trastornos.

Sumario de la invención 65 La presente invención proporciona una proteína que comprende polipéptidos de receptor IIB5 de activina humana (denominado ActRII B5) como se expone en la reivindicación 5. En una realización, la proteína comprende polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2. En otra realización la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos aproximadamente el 80% o mayor con SEC ID N°: 2, en el que el polipéptido es que capaz de unirse a miostatina, activina A, o GDF-11. En otra realización, la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos aproximadamente el 80% o mayor con SEC ID N°: 2, en el que el extremo e del polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 3 y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GOF-11. En otra realización la proteína comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos aproximadamente el 80% o más con SEC ID N°: 2, en el que el extremo C del polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de aproximadamente al menos el 80% o más con SEC ID N°: 3 y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GOF-11. En una realización, el polipéptido carece de una secuencia señal de ActRIIB5. En otra realización, la proteína comprende un polipéptido codificado por el polinucleótido que tiene la secuencia expuesta en SEC ID N°: 1.

En otra realización, la proteína de la presente invención comprende polipéptidos de ActRIIB5 fusionados a uno o más polipéptidos heterólogos. En una realización, los polipéptidos de ActRIIB5 fusionados carecen de una secuencia señal. En una realización los polipéptidos de ActRIIB5 están fusionados a los polipéptidos heterólogos a través de una o más secuencias enlazadoras. En otra realización los polipéptidos heterólogos comprenden un dominio Fc. En otra realización, el dominio Fc está conectado a los polipéptidos de ActRIIB5 por al menos una secuencia enlazadora. En otra realización los polipéptidos de ActRIIB5 están unidos a una molécula transportadora no proteica tal como una molécula de PEG.

En otro aspecto la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de ActRIIB5 como se expone en las reivindicaciones. En una realización, la molécula de ácido nucleico comprende (a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID N°: 1 o su complemento. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2 o su complemento. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende (c) un polinucleótido que se hibrida a (a)

o (b) en condiciones de al menos rigurosidad moderada en formamida a aproximadamente el 50%, SSC 6X a aproximadamente 42°C y condiciones de lavado de aproximadamente 60°C, SSC 0, 5X, SOS al 0, 1% Y en el que el polipéptido codificado comprende un extremo C que tiene una secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia polinucleotídica expuesta en SEC ID N°: 1 o su complemento;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2;

(e) la secuencia polinucleotídica que se hibrida a (a) o (b) en condiciones de rigurosidad moderada en aproximadamente el 50% de formamida, SSC 6X a aproximadamente 42 oC y condiciones de lavado de aproximadamente 60 oC, SSC O, 5X, SOS al 0, 1 % yen el que el polipéptido codificado comprende un extremo e que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 3 y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GOF-11; y

(d) la secuencia polinucleotídica que se hibrida a (a) o (b) en condiciones de rigurosidad moderada en

aproximadamente el 50% de formamida, SSC 6X a aproximadamente 42 oC y condiciones de lavado de aproximadamente 60 oC, SSC 0, 5X, SOS al 0, 1 % yen el que el polipéptido codificado comprende un extremo C que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80% idéntica a SEC ID N°: 3 y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GOF-11.

2. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2, en el que el polinucleótido comprende un extremo C que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 3 o en el que el polinucleótido comprende un extremo C que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 80% idéntica a SEC ID N°: 3.

3. La molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico comprende además polinucleótidos que codifican al menos una proteína heteróloga en fase con los polinucleótidos que codifican un receptor de activina de tipo IIB5, opcionalmente en el que la proteína heteróloga es un polipéptido de Fc, estando el polipéptido de Fc opcionalmente unido por un péptido enlazador.

4. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que consiste en la secuencia expuesta en SEC ID N°: 1.

5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polinucleótido está

unido operativamente a una secuencia reguladora transcripcional o traduccional, opcionalmente en el que la secuencia transcripcional o traduccional comprende un promotor o potenciador transcripcional.

6. Un vector recombinante que dirige la expresión de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una proteína aislada que comprende un polipéptido de receptor de activina de tipo IIB5, en el que el polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2, opcionalmente en el 45 que el resto de aminoácido 64 en SEC ID N°: 2 es alanina;

(b) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con SEC ID N°: 2, en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GOF-11;

(e) el polipéptido de (b) , en el que el extremo C del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 3; yen el que el polipéptido es capaz de unir miostatina, activina A o GOF-11; y

(d) el polipéptido de (b) , en el que el extremo C del polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con SEC ID N°: 3 y en el que el polipéptido es capaz de unirse a miostatina, activina A o GOF-11.

8. Una proteína aislada que comprende un polipéptido receptor de activina de tipo IIB5 en el que el polipéptido 55 consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2.

9. Una proteína aislada como se indica en la reivindicación 8, que carece de una secuencia señal de SEC ID N°: 2, específicamente los aminoácidos 1 a 17 de SEC ID N°: 2.

10. Una proteína aislada que comprende un polipéptido codificado por el polinucleótido expuesto en SEC ID N°: 1.

11. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, 9 ó 10, en la que el polipéptido se fusiona a al menos un polipéptido heterólogo, opcionalmente en la que la proteína heteróloga es un polipéptido de Fc, estando el polipéptido de Fc opcionalmente unido a través de una secuencia enlazadora.

12. Una célula hospedadora modificada por ingeniería genética para comprender un vector recombinante como se indica en la reivindicación 6 que i) dirige la expresión de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o ii) produce la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, siendo la célula hospedadora opcionalmente una célula de mamífero.

13. Un método para producir un polipéptido de receptor de activina IIB5 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 que está modificada por ingeniería genética para producir la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en condiciones que promueven la expresión del polipéptido y recuperación del polipéptido.

14. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de receptor de activina de tipo IIB5 de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 14, para su uso en la inhibición de la actividad de miostatina en un sujeto, el aumento de la masa muscular magra en un sujeto, el aumento de la fuerza muscular magra mediante el aumento de la proporción de masa de músculo magro a grasa en un sujeto o el tratamiento de una enfermedad de pérdida de músculo en un sujeto.

16. Una composición farmacéutica como se indica en la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un sujeto o para tratar una enfermedad en la cual la activina está sobreexpresada en un 20 sujeto.

17. La composición para su uso como se indica en la reivindicación 15 o reivindicación 16 en la que la enfermedad de pérdida de músculo se selecciona entre distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardiaca crónica, caquexia por cáncer, SIDA, insuficiencia renal, uremia, artritis reumatoide, sarcopenia relacionada con la edad, atrofia de órgano, síndrome del túnel carpiano, privación de andrógeno y pérdida de músculo debido a reposo en cama prolongado, lesión de médula espinal, apoplejía, fractura ósea y envejecimiento.

18. La composición para su uso como se indica en la reivindicación 16, en la que el trastorno metabólico se 30 selecciona entre diabetes, obesidad, hiperglucemia y pérdida ósea.

19. El vector de la reivindicación 6, en el que el vector es capaz de dirigir la expresión de polipéptido de ActRIIB5 en un sujeto, opcionalmente en el que el vector es un vector de AAV, para su uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida de músculo.