Reactivos para lisis de células bacterianas.

Composición que comprende una fase líquida acuosa, células bacterianas y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida con una concentración aproximada de 560 mM o superior,

caracterizada porque el compuesto iónico es seleccionado del grupo que consiste en 1-Butil-3-metil-imidazolio-tiocianato, 1-butil-5 3-metil-imidazolio-2(2- metoxi-etoxi) etilsulfato (ECOENGTM 41M), 1-metil-1- [4-(3-Metil-3H-imidazolio-1-)-butil]-1]H-imidazoliodi( toluilsulfato, y 1-butil-3-metil-imidazolio-octilsulfato

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10173913.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: VON DER ELTZ, HERBERT, BIRKNER, CHRISTIAN, Soukupova,Monika.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/06 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Lisis de microorganismos.

PDF original: ES-2376859_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Reactivos para lisis de células bacterianas La presente invención se refiere a reactivos y composiciones eficaces para la lisis de células biológicas. Un objetivo específico subyacente en la presente invención es dar a conocer reactivos de lisis capaces de efectuar la lisis de células bacterianas en ausencia de enzimas líticas, tales como (sin que ello sea limitativo) , una enzima de degradación de peptidoglicano.

La invención da a conocer una composición que comprende una fase líquida acuosa, células bacterianas, y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida, caracterizado porque el compuesto iónico es seleccionado entre el grupo que consiste en 1-butil-3-metil-imidazolio-tiocianato, 1-Butil-3-metil-imidazolio-2 (2-metoxi-etoxi) etilsulfato (ECO-ENG™41M) , 1-Metil-1-[4- (3-Metil-3H-imidazolio-1) -butil-1]-3H-imidazolio-di (toluilsulfatoo, y 1-Butil-3metilimidazolio-octilsulfato. Las composiciones de la invención se utilizan ventajosamente para preparar lisados de células biológicas, particularmente células bacterianas.

Antecedentes de la invención

En el proceso bioquímico de purificación de un analito a partir de un compartimento intracelular, la lisis de células es una de las primeras etapas a llevar a cabo y de mayor importancia. Con respecto a la pureza y rendimiento del analito obtenido finalmente, la forma de llevar a cabo la lisis tiene un impacto significativo sobre estos parámetros. Los métodos del estado de la técnica para llevar a cabo la lisis de células se basan ampliamente en el tratamiento mecánico y/o enzimático del material de muestra. Además, diferentes sustancias químicas son conocidas en el estado de la técnica para la desintegración de estructuras celulares y liberación de analitos. Son ejemplos de ello, los agentes caotrópicos y detergentes. En el caso en que uno o varios analitos tengan que ser purificados a partir de células bacterianas, los expertos en la materia están enfrentados a una serie de problemas generados por las características específicas de estas células.

Las bacterias son un grupo grande de microorganismos unicelulares. De manera típica, las bacterias tienen unas pocas micras de longitud, teniendo una amplia gama de formas comprendida desde esferas a bastones y espirales. Las células bacterianas están rodeadas por una membrana de lípido o membrana celular (a la que también se hace referencia como membrana citoplásmica) , que encierra el contenido de la célula y actúa como barrera para retener nutrientes, proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes esenciales del citoplasma que se encuentra dentro de la célula. Dado que son procariotas, las bacterias no tienden a tener orgánulos limitados por membranas en su citoplasma y, por lo tanto, contienen pocas estructuras intracelulares grandes.

En la mayor parte de las bacterias, pero no en todas ellas, una pared celular bacteriana cubre la parte externa de la membrana de la célula. La pared de la célula es una capa resistente, flexible o rígida, que rodea la membrana de la célula. Por lo tanto, está situada por fuera de la membrana de la célula y proporciona a la célula un soporte estructural y protección, y actúa también como mecanismo de filtrado. La pared de la célula es esencial para la supervivencia de muchas bacterias. Una función principal de la pared de la célula es la de actuar como recipiente a presión, impidiendo la sobreexpansión cuando entra agua en la célula. Las paredes de las células bacterianas están realizadas a base de peptidoglicano (también conocido como moreina) como componente principal. El peptidoglicano es sintetizado a partir de cadenas de polisacáridos reticuladas por ciertos péptidos que contienen D aminoácidos. Las paredes de células bacterianas son distintas de las paredes de células de plantas y hongos, que están realizadas a base de celulosa y quitina, respectivamente. La pared de las células bacterianas es distinta también de la de las Arqueas, que no contienen peptidoglicano.

La tinción Gram es un método empírico de diferenciación de especies bacterianas en Gram positivas y Gram negativas, basándose en las propiedades químicas y físicas de las paredes de sus células. Si bien la tinción Gram es una herramienta de diagnóstico valiosa, tanto en el campo clínico como en la investigación, no todas las bacterias pueden ser claramente clasificadas por esta técnica, formando, por lo tanto, grupos Gram variable y Gram indeterminante.

Las bacterias Gram positivas poseen paredes celulares de tipo rejilla gruesa conteniendo muchas capas de peptidoglicano y ácidos teicoicos. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas tienen aspecto púrpura en la tinción Gram. Como contraste, las bacterias Gram negativas tienen una pared celular delgada que consiste solamente de unas pocas capas de peptidoglicano, rodeada por una segunda membrana lípida que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas. Las paredes celulares de bacterias Gram negativas tienen tinción de color rosa.

Para purificar un analito a partir de un compartimento intracelular de células bacterianas, se conocen varios métodos para romper las células y liberar sus componentes citoplásmicos.

Los métodos mecánicos se basan frecuentemente en la utilización de la rotura del material en un molino de bolas por molturación. Al mismo tiempo, se generan fuerzas de cizalladura significativas. Dependiendo del analito a aislar, la cizalladura es una desventaja, por ejemplo, cuando se tienen que purificar ácidos nucleicos.

La homogeneización basada en líquido es la técnica de dislocación de células, más ampliamente utilizada para pequeños volúmenes. Las células son sometidas a lisis al forzar la célula o suspensión de tejidos a través de un espacio estrecho, cizallando de esta manera las paredes de la célula y las membranas. Se conocen tres tipos distintos de homogeneizadores en el estado de la técnica. Un homogeneizador Dounce consiste en un mango redondo de cristal que es impulsado manualmente dentro de un tubo de cristal. Un homogeneizador Potter-Elvehjem consiste en un mango impulsado manualmente o mecánicamente, conformado para acoplarse a un recipiente de forma redonda o cónica. El número de sacudidas y la velocidad a las que éstas son llevadas a cabo, influye en la eficacia de los métodos de homogeneización Dounce y Potter-Elvehjem. No obstante, debido a un funcionamiento básicamente manual, estos homogeneizadores no son adecuados para una elevada manipulación de muestras. Asimismo, resulta difícil el proceso de volúmenes de muestras muy pequeñas.

Una prensa French consiste en un émbolo que es utilizado para aplicar una alta presión a un volumen de muestra, forzándolo a través de un pequeño orificio de la prensa. La prensa French es frecuentemente el método preferido para la rotura mecánica de células bacterianas. No obstante, el dispositivo es caro y tampoco es adecuado para la preparación de muestras con una elevada producción.

La sonicación es otro método de dislocación física, habitualmente utilizada para abrir las células. El método utiliza ondas sonoras de alta frecuencia, pulsadas, para agitar y efectuar la lisis de las bacterias, y en algunos casos, incluso de esporas. Las ondas sonoras son suministradas utilizando un aparato con una sonda vibrante que es sumergida en la suspensión líquida de células. La energía mecánica de la sonda inicia la formación de burbujas de vapor microscópicas que se forman momentáneamente y sufren implosión, provocando ondas de choque que se radian a través de la muestra. Para impedir un calentamiento excesivo, se aplica un tratamiento ultrasónico en muchas ráfagas cortas a una muestra sumergida en un baño de hielo.

De manera alternativa, se puede utilizar el método de congelación/descongelación para la lisis de células bacterianas. La técnica comporta la congelación de una suspensión de células en un baño seco de hielo/etanol o en una nevera, y luego descongelar el material a temperatura ambiente o 37º C. Este método de lisis provoca el hinchamiento de las células y finalmente su rotura, dado que se forman cristales de hielo durante el proceso de congelación, y luego se contraen durante la descongelación. Son necesarios múltiples ciclos para una lisis eficaz, y el proceso puede ser muy largo.

Para hacer el proceso de lisis más eficaz, las células se pueden incubar adicionalmente con lisozima (N acetilmuramida glicanhidrolasa) , de manera que las paredes de las células se degradan. La enzima funciona atacando los peptidoglicanos (que se encuentran en las paredes de las células... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Composición que comprende una fase líquida acuosa, células bacterianas y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida con una concentración aproximada de 560 mM o superior, caracterizada porque el compuesto iónico es seleccionado del grupo que consiste en 1-Butil-3-metil-imidazolio-tiocianato, 1-butil-3-metil-imidazolio-2 (2metoxi-etoxi) etilsulfato (ECOENG™ 41M) , 1-metil-1-[4- (3-Metil-3H-imidazolio-1-) -butil]-1]H-imidazoliodi (toluilsulfato, y 1-butil-3-metil-imidazolio-octilsulfato.

2. Composición, según la reivindicación 1, que comprende, además, una sal tampón capaz de acción tampón a pH ácido.

3. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque el pH de la composición es ácido.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende, además, una fase sólida con una superficie de sílice.

5. Composición, según la reivindicación 4, caracterizada porque la fase sólida comprende partículas susceptibles de atracción magnética.

6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el compuesto iónico es en 1Butil-3-metil-imidazolio-tiocianato.

7. Utilización de una composición que comprende una fase líquida acuosa y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida a una concentración aproximada de 560 mM o superior, para destruir la pared celular de una célula bacteriana, de manera que el compuesto iónico es seleccionado del grupo que consiste en 1-Butil-3-metilimidazolio-tiocianato, 1-Butil-3-metil-imidazolio-2 (2-metoxietoxi) etilsulfato (ECOENG™ 41M) , 1-metil-1-[4- (3-metil3H-imidazolio-1) -butil-1-]-3H-imidazolio-di (toluilsulfato, y 1-butil-3-metil-imidazolio-octilsulfato.

8. Método para la producción de un lisado de células bacterianas, cuyo método comprende (a) contacto de las células bacterianas con una composición que comprende una fase líquida acuosa, y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida a una concentración aproximada de 560 mM o superior, de manera que el compuesto iónico es seleccionado entre el grupo que consiste en 1-Butil-3-metilimidazolio-tiocianato, 1-Butil-3-metil-imidazolio-2 (2metoxietoxi) etilsulfato (ECOENG™ 41M) , 1-Metil-1-[4- (3-Metil-3H-imidazolio-1-) -butil-1-]-3H-imidazoliodi (toluilsulfato) , y 1-Butil-3-metil-imidazolio-octilsulfato, y (b) incubar la célula bacteriana con la fase líquida, produciendo de esta manera un lisado de la célula bacteriana.

9. Método, según la reivindicación 8, caracterizado porque la célula bacteriana es Gram positiva, el compuesto iónico disuelto en la fase líquida es 1-Metil-1-[4- (3-Metil-3H-imidazolio-1-) -butil-1-]-3H-imidazolio-di (toluilsulfato) , y la concentración del compuesto iónico en la fase líquida es aproximadamente de 560 mM.

10. Método, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula bacteriana es Gram negativa, el compuesto iónico disuelto en la fase líquida es [BMIM-SCN], y la concentración del compuesto iónico en la fase líquida es aproximadamente de 560 mM.

11. Composición que comprende una fase líquida acuosa, células bacterianas Gram negativas y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida con una concentración aproximada de 370 mM o superior, caracterizada porque el compuesto iónico es 1-Butil-3-metil-imidazolio-octilsulfato.

12. Utilización de la composición, según la reivindicación 11, para la destrucción de la pared celular de células bacterianas Gram negativas.

13. Método para la producción de un lisado de células bacterianas Gram negativas, cuyo método comprende (a) contacto de las células bacterianas con una composición que comprende una fase líquida acuosa, y un compuesto iónico disuelto en la fase líquida a una concentración aproximada de 370 mM o superior, de manera que el compuesto iónico es 1-Butil-3-metil-imidazolio-octilsulfato, y (b) incubar las células bacterianas con la fase líquida, produciendo de esta manera un lisado de las células bacterianas Gram negativas.

14. Método de purificación de un ácido nucleico de una célula, comprendiendo las etapas de (a) destruir la pared celular de la célula, si existe pared celular; (b) contacto e incubación de la célula con una solución acuosa ácida, comprendiendo 1-Butil-3-metil-imidazolio-tiocianato a una concentración de 1, 5 M o superior, formando de esta manera un lisado; (c) contacto del lisado con una fase sólida que comprende una superficie de sílice, de manera que el ácido nucleico es adsorbido a la superficie; (d) separar la fase sólida de la fase líquida y, opcionalmente, lavar la fase sólida, de manera que el ácido nucleico permanece adsorbido en la misma; y (e) eluir el ácido nucleico de la fase sólida, purificando de esta manera el ácido nucleico.

15. Método, según la reivindicación 14, caracterizado porque la célula se encuentra presente en una muestra biológica.

 

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