Purificación mejorada de colagenasas a partir de un cultivo líquido de Clostridium histolyticum.

Un método para purificar proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II del Clostridium histolyticum a partir de unamezcla compleja,

que consta de los pasos siguientes:

(a) preparar la mezcla compleja disuelta en una fase líquida acuosa;

(b) formar un precipitado de proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II disolviendo el sulfato amónico en la faselíquida del paso (a);

(c) separar el precipitado del paso (b) de la fase líquida;

(d) disolver el precipitado del paso (c) en un tampón acuoso que contiene iones 10 Ca2+ y tiene un pH entre 6,0 y 8,0, yajustar la conductividad del tampón con el precipitado disuelto a un valor comprendido entre 50 y 300 mS/cm,formándose una solución compleja tamponada que contiene las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II;

(e) extraer la solución compleja tamponada del paso (d) poniéndola en contacto con una fase estacionaria hidrófobay adsorbiendo las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II sobre la fase estacionaria;

(f) separar la fase estacionaria hidrófoba junto con las proteínas de colagenasas adsorbidas de tipo I y de tipo II delpaso (e) de la solución extraída;

(g) eluir las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II de la fase estacionaria del paso (f);purificando de este modo las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II.

Purificación mejorada de colagenasas a partir de un cultivo líquido de Clostridium histolyticum

La presente invención pertenece al ámbito de la bioquímica de proteínas y se refiere a métodos para obtener las enzimas colagenasas I y II purificadas de C. histolyticum. Una ventaja técnica especial de la invención consiste en la mejora de la separación rápida de las enzimas deseadas de las actividades proteolíticas concomitantes, en particular de la proteasa clostripaína. Cuando se realiza la purificación con arreglo a la presente invención, las colagenasas son especialmente apropiadas como ingredientes de mezclas de proteasas para la disociación de tejidos.

La presente invención proporciona un método de purificación de las proteínas de las colagenasas de tipo I y de tipo II del Clostridium histolyticum a partir de una mezcla compleja realizando sucesivamente (a) la precipitación con sulfato amónico, cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía aniónica. Se facilitan las condiciones que conducen a una preparación purificada y parcialmente estabilizada, incluso después del paso de la precipitación. El método de la invención conduce a la eliminación rápida y eficaz de otras actividades proteolíticas. Las preparaciones según la invención proporcionan las proteínas colagenasa de tipo I y de tipo II excepcionalmente puras e intactas, que son enzimáticamente activas. La invención proporciona también mezclas de las dos proteínas aisladas. La invención proporciona además el uso de proteínas de colagenasas purificadas o mezclas de las mismas para tratar una muestra de tejido “in vitro”.

Antecedentes de la invención

Las colagenasas microbianas (EC 3.4.24.3) son metaloproteinasas que degradan las regiones helicoidales del colágeno nativo, reduciéndolas a fragmentos pequeños. El punto de rotura preferido es el -Gly de la secuencia -Pro-Xaa-Gly-Pro-. Se han aislado seis formas principales, agrupadas en dos clases, del Clostridium histolyticum que tienen una reactividad inmunológica cruzada, pero que tienen diferentes secuencias y diferentes especificidades. Se han aislado otras variantes a partir del Bacillus cereus, Empedobacter collagenolyticum, Pseudomonas marinoglutinosa, y de especies de Vibrio y Streptomyces.

Las colagenasas intervienen en la destrucción de las estructuras extracelulares en la patogénesis de bacterias del tipo Clostridium histolyticum. Por consiguiente son exotoxinas y actúan como factores de virulencia, p.ej. facilitando la propagación de gangrena gaseosa.

Las colagenasas se dirigen normalmente al tejido conjuntivo de las células musculares y de otros órganos. Debido a su potente actividad hidrolítica del tejido conjuntivo, las colagenasas y otras proteinasas, por ejemplo la termolisina, se emplean para la disociación de tejidos “in vitro”.

Las colagenasas producidas por el Clostridium histolyticum fueron las primeras colagenasas que se descubrieron y caracterizaron. El líquido filtrado del cultivo de Clostridium histolyticum contiene una mezcla de colagenasas y otras proteinasas.

Se han purificado hasta la homogeneidad seis colagenasas principales que tienen pesos moleculares comprendidos entre 68 y 130 kDa y se han denominado colagenasas de tipo I y de tipo II (ambos grupos de proteínas se denominan también en este escrito colectivamente “proteínas de colagenasas”) . Dichas colagenasas clostridianas contienen aproximadamente un átomo de cinc por cadena proteica, dicho átomo de cinc parece ser esencial con vistas a la actividad enzimática.

A escala industrial se han aislado las colagenasas clostridianas del líquido filtrado del cultivo de Clostridium histolyticum. Las preparaciones en bruto contienen las colagenasas y también un pigmento marrón, la clostripaína (clostridiopeptidasa B) , una aminopeptidasa y varias proteinasas neutras. Las preparaciones en bruto pueden servir para la purificación de las colagenasas individuales de tipo I y II, pero el trabajo de purificación es muy largo.

La presencia de la cisteína-proteasa clostripaína en la mezcla plantea un problema técnico importante, porque esta peptidasa hidroliza progresivamente las colagenasas. A este respecto, la colagenasa de tipo I parece ser más sensible al ataque proteolítico de la clostripaína que la colagenasa de tipo II. Cuando se purifican las colagenasas del líquido filtrado del cultivo o del líquido sobrenadante del cultivo de C. histolyticum es deseable separar la clostripaína en un paso temprano para minimizar las pérdidas.

Bond, M.D., Van Wart, H.E., (Biochemistr y 23, 3077-3085, 1984) describen un esquema de purificación basado en la cromatografía, que se inicia con una preparación enzimática en bruto. En el primer paso se cromatografía la enzima en bruto a través de hidroxilapatita. El mecanismo de la cromatografía de la hidroxilapatita se conoce también como intercambio iónico en “modo mixto”. Incluye interacciones inespecíficas entre iones calcio cargados positivamente e iones fosfato cargados negativamente de la fase estacionaria de resina de hidroxilapatita con grupos carboxilo de proteína cargados negativamente y grupos amino cargados positivamente. Para la elución se emplea normalmente un tampón que tiene una concentración creciente de fosfato. Según Bond, M.D., Van Wart, H.E. (lugar citado) se eluyen tres fracciones con un gradiente de fosfato potásico. La primera fracción contiene la mayor parte del pigmento y la tercera fracción contiene el 95% de la actividad de la colagenasa. La tercera fracción se somete además a cromatografía de filtración a través de gel en una columna Sephacr y l™ S200, y después por cromatografía de afinidad a través de L-arginina-AffiGel™ 202. Se combinan estos pasos y en el orden indicado sirven para separar el pigmento marrón y la mayor parte de las proteinasas contaminantes activas contra la caseína, el éster de etilo de la benzoil-L-arginina y la elastina. Por cromatografía con ligando de colorante rojo reactivo llamado Reactive Red™ 120 se subdividen las colagenasas de tipo I y de tipo II.

En WO 2003/004628 se describe un esquema de purificación en el que el líquido sobrenadante del cultivo de C. histolyticum se cromatografía sucesivamente a través de (1) hidroxilapatita, (2) una resina de intercambio aniónico y

(3) una resina de intercambio catiónico. La tercera fracción que se eluye de la columna de la hidroxilapatita contiene la fracción I/II de las colagenasas pero también contiene la clostripaína. Se eluye la resina de intercambio aniónico para separar las dos fracciones de colagenasa I y colagenasa II. Sin embargo, ambas fracciones siguen conteniendo clostripaína. Las colagenasas se separan de la clostripaína con una resina de intercambio catiónico. Los métodos recién descritos constituyen distintas estrategias cromatográficas, cuya finalidad es eliminar la clostripaína molesta de las colagenasas.

En WO 2007/089851 se describe la evaluación de la precipitación con sulfato amónico como paso primario de recuperación de las proteínas de colagenasas a partir del líquido filtrado de cultivo, que contiene cantidades significativas de otras proteasas, por ejemplo la clostripaína. Por consiguiente se añade sulfato amónico al líquido filtrado, inicialmente en concentraciones comprendidas entre 100 y 400 g/l y después en concentraciones entre 400 y 520 g/l. Se ha constatado que la recuperación de la colagenasa por precipitación es significativa en 400 g/l y se encuentra que el culote generado empleando esta concentración es más fácil de suspender de nuevo. Además, las concentraciones superiores a 400 g/l dan lugar aparentemente a una recuperación muy similar con respecto a las proteínas de colagenasas.

Con el fin de producir colagenasas a mayor escala, en WO 2007/089851 se describe la combinación de (1) una cepa de C. histolyticum elegida especialmente, (2) un proceso de fermentación en condiciones que optimizan la producción de colagenasas al tiempo que intentan reducir la producción de clostripaína y (3) un esquema de purificación de las colagenasas I/II.

Ambos elementos, la elección de la cepa de C. histolyticum y la fermentación en medio líquido contribuyen a reducir la clostripaína en el material en bruto empleado para el proceso de purificación. Por consiguiente, hay que tener en cuenta que las condiciones descritas en WO 2007/089851 son las de un esquema de purificación basado en la preparación en bruto con... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II del Clostridium histolyticum a partir de una mezcla compleja, que consta de los pasos siguientes:

(a) preparar la mezcla compleja disuelta en una fase líquida acuosa;

(b) formar un precipitado de proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II disolviendo el sulfato amónico en la fase líquida del paso (a) ;

(c) separar el precipitado del paso (b) de la fase líquida;

(d) disolver el precipitado del paso (c) en un tampón acuoso que contiene iones Ca2+ y tiene un pH entre 6, 0 y 8, 0, y ajustar la conductividad del tampón con el precipitado disuelto a un valor comprendido entre 50 y 300 mS/cm, formándose una solución compleja tamponada que contiene las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II;

(e) extraer la solución compleja tamponada del paso (d) poniéndola en contacto con una fase estacionaria hidrófoba y adsorbiendo las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II sobre la fase estacionaria;

(f) separar la fase estacionaria hidrófoba junto con las proteínas de colagenasas adsorbidas de tipo I y de tipo II del paso (e) de la solución extraída;

(g) eluir las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II de la fase estacionaria del paso (f) ; purificando de este modo las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II.

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque después del paso (c) en el material susceptible de disolución del precipitado se reduce la actividad proteolítica de la clostripaína en un factor de 90 a 150 y se reduce la actividad tríptica en un factor de 100 a 400, referido a las actividades proteolíticas respectivas de la mezcla compleja disuelta del paso (a) .

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II del paso (g) se siguen purificando por cromatografía de intercambio catiónico, con lo cual se sigue separando la actividad proteolítica residual de las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II.

4. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque las proteínas de tipo I y tipo II obtenidas después de la cromatografía de intercambio catiónico se separan ejecutando los pasos siguientes:

(A) poner en contacto las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II purificadas adicionalmente con una fase estacionaria de intercambio aniónico, y adsorber las proteínas de colagenasas de tipo I y de tipo II sobre la fase estacionaria;

(B) eluir, en fracciones separadas, las proteínas de la colagenasa de tipo I y la colagenasa de tipo II a partir de la fase estacionaria del paso (A) ;

con lo cual se purifican por separado las proteínas de la colagenasa de tipo I y la colagenasa de tipo II.

5. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque aprox. el 82% de la proteína de colagenasa de tipo I de la fracción de colagenasa de tipo I obtenida en el paso (B) tiene un peso molecular de aprox. 114 kDa.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque aprox. el 82% de la proteína de colagenasa de tipo I de la fracción de colagenasa de tipo I obtenida en el paso (B) está intacta en su extremo N.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 6, caracterizado porque la actividad de clostripaína de la fracción de colagenasa de tipo I obtenida en el paso (B) es menor que aprox. 0, 04 U/mg de proteína.

8. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque aprox. el 93% de la proteína de colagenasa de tipo II de la fracción de colagenasa de tipo II obtenida en el paso (B) tiene un peso molecular de aprox. 112 kDa.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 8, caracterizado porque aprox. el 93% de la proteína de colagenasa de tipo II de la fracción de colagenasa de tipo II obtenida en el paso (B) está intacta en su extremo N.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 8 y 9, caracterizado porque la actividad de clostripaína de la fracción de colagenasa de tipo II obtenida en el paso (B) es menor que aprox. 0, 07 U/mg de proteína.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 7, caracterizado porque en un paso posterior se mezclan una primera cantidad medida de la proteína de colagenasa de tipo I de la fracción de colagenasa de tipo I obtenida en el paso (B) y una segunda cantidad medida de proteína de colagenasa de tipo II.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 8 y 9, caracterizado porque en un paso posterior se mezclan una primera cantidad medida de la proteína de colagenasa de tipo II de la fracción de colagenasa de tipo II obtenida en el paso (B) y una segunda cantidad medida de proteína de colagenasa de tipo I.