Proteínas quiméricas l1 del virus del papiloma humano 16 que contienen un péptido l2, partículas tipo virus preparadas a partir de estas proteínas y un método para preparar las partículas.
Un método para producir un polipéptido L1 quimérico del virus de papiloma humano (HPV) que contiene un péptido L2 del HPV,
preferiblemente un polipéptido o péptido del HPV-16, comprendiendo el método las etapas de: introducir una secuencia de ADN que codifica para el péptido L2 en una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido L1; introducir la secuencia de ADN que incluye las secuencias para el polipéptido L1 y el péptido L2 en una célula huésped en la cual se puede expresar la secuencia de ADN; causar la expresión de la secuencia de ADN, preferiblemente o bien en un sistema de expresión de procariota o en un sistema de expresión de eucariota; y recuperar al polipéptido quimérico L1 resultante que incluye al péptido L2
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2003/001912.
Solicitante: UNIVERSITY OF CAPE TOWN.
Nacionalidad solicitante: Sudáfrica.
Dirección: LOVERS WALK RONDEBOSCH CAPE TOWN AFRICA DEL SUR.
Inventor/es: VARSANI,ARVIND,DEVSHI, RYBICKI,EDWARD,PETER.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/025 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Papovaviridae, p. ej. virus de papiloma, virus del polioma, SV40, virus BK, virus JC.
- C12N15/37 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Papovaviridae, p. ej. virus del papiloma, virus del polioma, SV 40.
PDF original: ES-2323634_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Proteínas quiméricas L1 del virus del papiloma humano 16 que contienen un péptido L2, partículas tipo virus preparadas a partir de estas proteínas y un método para preparar las partículas.
Antecedentes de la invención
La invención se relaciona con un método para preparar polipéptidos, y en particular partículas tipo virus (VLP) o capsómeros del virus del papiloma humano.
Los virus del papiloma son un grupo de virus de ADN pequeño, que inducen verrugas y otras lesiones en una variedad de vertebrados superiores incluidos los humanos.
Los virus del papiloma (PV) son miembros del género Papillomavirus, familia Papillomaviridae, y contienen un genoma circular de ADN bicatenario con un tamaño típico de 7.900 pares de bases (Seedorf y colaboradores, 1985). Todos los PV tienen una organización genómica similar, con una región génica temprana que codifica proteínas involucradas en la replicación del ADN y en la transformación celular, y una región tardía que codifica las proteínas de la cápside viral (Figura 1). Una región no codificadora conocida como la región larga de control (LCR) contiene elementos de control para transcripción y replicación.
Los virus del papiloma codifican dos proteínas virales estructurales, L1 y L2. El virión contiene 360 moléculas L1 1 dispuestas como 72 capsómeros, cada uno de los cuales es un pentámero compuesto de cinco moléculas L1 (Baker y colaboradores, 1991). La proporción de moléculas L1 a L2 ha sido estimada aproximadamente en 30:1 (Doobar y colaboradores, 1987), lo que sugiere que cada virión contendría aproximadamente doce moléculas L2. El mayor número de moléculas L1 por virión ha conducido a denominar a L1 como a la proteína "principal" de la cápside y a denominar a L2 como a la proteína "secundaria" de la cápside.
L1 de HPV-16 es codificada por un gen de 1.518 kb, dando lugar a una proteína de 504 aminoácidos. L1 1 tiene un peso molecular de 55 a 58 kD (Browne y colaboradores, 1988). Los dominios de L1 probablemente median el enlazamiento celular y contengan determinantes antigénicos que median las respuestas inmunes de las células T y del anticuerpo al virus.
Entre los virus del papiloma humano genital (HPV) existen HPV de bajo riesgo (por ejemplo, HPV 6 y HPV 11) que causan verrugas genitales y lesiones cervicales que usualmente retroceden o no progresan hasta malignidad, y genotipos de alto riesgo (u oncogénicos) (por ejemplo, HPV 16 y HPV 18), que están asociados en gran medida con lesiones cervicales y carcinomas. Los HPV han sido considerados también como los agentes etiológicos en varios otros cánceres anogenitales y del tracto aerodigestivo (Breitburd y colaboradores, 1999). Un cuerpo apremiante de evidencia clínica, molecular, experimental y epidemiológica ha establecido que ciertos tipos de HPV son la causa principal del cáncer cervical (Lowy y colaboradores, 1994; IARC, 1995).
HPV 16 está presente en la mayoría de los casos del cáncer cervical y tres tipos adicionales (HPV 18, 31 y 45) están presentes en aproximadamente un 30% adicional de los casos (IARC, 1999).
Aunque la incidencia del cáncer cervical está disminuyendo en los EU, es la neoplasia maligna más frecuente en mujeres en países en desarrollo, con aproximadamente 500.000 nuevos casos diagnosticados cada año.
Tradicionalmente, la mayoría de las vacunas profilácticas han consistido de virus vivos atenuados de virus inactivados con formalina. Los viriones del virus de papiloma son altamente inmunogénicos, induciendo títulos altos (> 100.000) de anticuerpos de neutralización cuando se los inocula sistémicamente (Doretzky y colaboradores, 1980; Kimbauer y colaboradores, 1991, 1992). Sin embargo, debido a las dificultades y a los riegos involucrados en la generación de grandes cantidades de estas vacunas tradicionales, se ha hecho un gran énfasis en el desarrollo de subunidades de proteína viral o de vacunas de partículas tipo virus (VLP).
La mejor proteína candidata para una vacuna profiláctica contra HPV es la proteína principal L1 de la cápside, que se autoensambla en las VLP (Schiller y Lowy, 2001). Estas VLP están muy bien caracterizadas, y morfológicamente parecen indistinguibles de todos los viriones (Chen y colaboradores, 2001; Rose y colaboradores, 1993). La inyección de las VLP en animales experimentales induce anticuerpos neutralizadores (Rose y colaboradores, 1998); los ensayos preliminares en humanos de vacunas inyectadas de VLP han demostrado también que estas son bien toleradas y son altamente inmunogénicas, y en el último caso, estimularon respuestas robustas de células B y T (Evans y colaboradores, 2001; Harro y colaboradores, 2001).
Una vacuna profiláctica barata ye efectiva contra tipos oncogénicos de los HPV mucotrópicos podría tener un impacto potencial sobre el agobio del cáncer en el mundo, especialmente contra HPV 16.
Un epítopo común de neutralización para los HPV tipos 6 y 16 ha sido encontrado en la región (aa) 108 - 120 de la proteína secundaria de la cápside del HPV 16, L2 (Kawana y colaboradores, 1998, 1999). Los ratones Balb/c que fueron inmunizados en forma nasal con un péptido sintético correspondiente al epítopo produjeron una respuesta inmune que resultó en anticuerpos IgA e IgG que reaccionan en forma cruzada con las cápsides L1/L2 del HPV 6, 16 y 18 (Kawana y colaboradores, 2001). La inmunización de conejos con cualquiera de los dos péptidos que se superponen derivados de la región 94 - 122 de la secuencia L2 ya sea virus del papiloma oral de conejo (ROPV) o virus del papiloma del conejo común (CRPV) dio como resultado sueros que reaccionaron con el análogo purificado L2, específicamente el L2 reconocido en células infectadas y en virus neutralizado in vitro. Los conejos inmunizados con péptidos del CRPV fueron inmunes al reto del CRPV (Embers y colaboradores, 2002).
Los inventores decidieron por lo tanto investigar adicionalmente la presentación de este epítopo L2 sobre las VLP L1 quiméricas como vacuna por sí mismas, y como modelo para la presentación de otras secuencias de péptidos inmunogénicos.
En relación con el estado del arte, Müller y colaboradores (1997, Virology, vol. 234 (1), páginas 93 - 111) describen proteínas quiméricas L1 del HPV 16 que tienen insertada una secuencia E7 del HPV-16 ya sea en la posición C-terminal o en una posición intermedia.
Además, Slupetzlay y colaboradores (2001, J. Gen. Virol, vol. 82, páginas 2799 - 2804) describen proteínas quiméricas L1 del HPV-16 que tienen insertadas en diferentes bucles de la superficie de la cápside al epítopo LELDKWAS del péptido de la célula B de 8aa del gp41 del VIH-1.
Resumen de la invención
De acuerdo con una primera modalidad de la invención, se provee un método parta producir un polipéptido L1 del virus de papiloma humano quimérico (HPV) que contiene un péptido L2 del HPV, comprendiendo el método las etapas de:
El polipéptido L1 del HPV y/o el péptido L2 del HPV pueden ser un polipéptido o péptido del HPV-16.
El péptido L2 del HPV puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: LVEETSFIDAGAP (SEQ ID NO: 1), o una secuencia que sea una modificación o derivada de la misma, con la condición de que la secuencia derivada o modificada sea una secuencia que tenga al menos 80% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que codifique para un péptido que produzca una respuesta inmunogénica contra el HPV.
Uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN para L1 puede ser suprimida en el punto de introducción de la secuencia de ADN para L2, y típicamente el número de nucleótidos suprimidos de la secuencia para L1 corresponderá... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un método para producir un polipéptido L1 quimérico del virus de papiloma humano (HPV) que contiene un péptido L2 del HPV, preferiblemente un polipéptido o péptido del HPV-16, comprendiendo el método las etapas de:
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el péptido L2 del HPV tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: LVEETSFIDAGAP (SEQ ID NO: 1), o una secuencia que sea una modificación o derivada de la misma, con la condición de que la secuencia derivada o modificada sea una secuencia que tenga al menos 80% de homología con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y que codifique para un péptido capaz de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
3. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde se suprimen uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN para L1 en el punto de introducción de la secuencia de ADN para L2, y preferiblemente el número de nucleótidos suprimido de la secuencia de ADN para L1 corresponde con el número de nucleótidos insertados para L2.
4. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las Figuras 6, 8, 10, 12 y 14 (SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13), o una secuencia que sea al menos 80% homóloga con cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13 y que es capaz de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
5. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido quimérico tiene una secuencia de ADN establecida en cualquiera de las Figuras 5, 7, 9, 11 y 13 (SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12), o una secuencia que tiene al menos 80% de homología con cualquiera de estas secuencias y que codifica para un polipéptido capaz de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
6. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el polipéptido quimérico L1 es capaz de ensamblarse dentro de las partículas tipo virus y/o los capsómeros, preferiblemente las partículas inmunogénicas tipo virus o los capsómeros.
7. Una secuencia de ADN para L1 quimérico del virus de papiloma humano (HPV) dentro de la cual se ha insertado una secuencia de ADN que codifica para un péptido L2 del HPV (SEQ ID NO: 1), que es capaz de expresar al péptido L2 del HPV.
8. Una secuencia de ADN para L1 del HPV de acuerdo a la reivindicación 7, en donde uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN para L1 han sido suprimidos en el punto de introducción de la secuencia de ADN para L2, y preferiblemente el número de nucleótidos suprimidos de la secuencia para L7 corresponde con el número de nucleótidos insertados para L2.
9. Una secuencia de ADN del virus de papiloma humano que tiene una secuencia de ADN establecida en cualquiera de las Figuras 5, 7, 9, 11 y 13 (SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12), o una secuencia de ADN que es una modificación o derivada de la misma, con la condición de que la secuencia modificada o derivada de ADN tenga al menos 80% de homología con cualquiera de las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 y 12 y que codifique para un péptido quimérico L1 que presente un péptido L2 del HPV, siendo el péptido quimérico L1 capaz de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
10. Un vector que incluye una secuencia de ADN como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Una célula huésped que incluye un vector como el reivindicado en la reivindicación 10.
12. Un polipéptido quimérico L1 del virus de papiloma humano (HPV), preferiblemente una partícula quimérica L1 tipo virus del HPV o capsómero, incluido un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: LVEETSFIDA GAP (SEQ. ID NO: 1).
13. Un polipéptido del virus de papiloma humano (HPV) que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las Figuras 6, 8, 10, 12 y 14 (SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13), o una secuencia que sea una modificación o derivada de la misma, con la condición de que la secuencia de aminoácidos modificada o derivada tenga al menos 80% de homóloga con cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11 y 13 y sea un péptido quimérico L1 que presente un péptido L2 del HPV, siendo capaz el péptido quimérico L1 de producir una respuesta inmunogénica contra el HPV.
14. Un método para producir un polipéptido quimérico L1 del virus de papiloma humano (HPV) que contiene un péptido heterólogo, comprendiendo el método las etapas de:
15. Un método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde la secuencia heteróloga del péptido es cualquier otras secuencia del HPV o se deriva de cualquier epítopo antigénico, célula B o célula T específica.
16. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, en donde uno o más nucleótidos de la secuencia de ADN para L1 se suprimen en el punto de introducción de la secuencia de ADN heterólogo, y preferiblemente el número de nucleótidos suprimidos de la secuencia de L1 corresponde con el número de nucleótidos heterólogos insertados.
17. Una vacuna que incluye un polipéptido quimérico L1 del virus del papiloma humano (HPV) como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13 o una secuencia de ADN como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, preferiblemente para uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de una infección con HPV, y más preferiblemente para uso en el tratamiento de HPV 6, 16 ó 18.
18. Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 17, que es capaz de inducir una respuesta inmunogénica para HPV y/o para el péptido introducido en un huésped adecuado, y que comprende además un excipiente y/o adyuvante farmacéutico.
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