Fragmentos proteicos poliepitópicos de las proteinas E6 y E7 de HPV , su obtencion y sus utilizaciones particularmente en vacunación.

Utilización de fragmentos poliepitópicos que contienen 6 epítopos de la proteína E6 de HPV,

elegidos entre aquellos queincluyen:

- el fragmento que contiene 6 epítopos delimitados por 5 los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o en lasposiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6, este último fragmento estando caracterizado por lasecuencia peptídica siguiente:(46)RREVYDF AFRDLCIVYRDGNPY(67)dicho fragmento conteniendo los péptidos, cada péptido ligándose de manera estable a una al menos de lasmoléculas HLA de tipo A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los siguientes:

- (46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

- (49)VYDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

- (50)YDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

- (52)FAFRDLCIV(60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7;

- (54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

- (59)IVYRDGNPY(67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11

y las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados,

- por sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o

- por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o

- por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormentemencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos opseudopéptidos, cada péptido ligándose específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellasligándose a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de los cuales éstasderivan, para la preparación de un medicamento o vacuna destinado a la prevención o al tratamiento de patologíasligadas a la infección de individuos por los papillomavirus humanos; tales como las neoplasias cervicalesintraepiteliales (CIN), el cáncer invasivo del cuello del útero, las neoplasias vulvares intraepiteliales (VIN).

Fragmentos proteicos poliepitópicos de las proteínas E6 y E7 de HPV, su obtención y sus utilizaciones particularmente en vacunación

La presente invención se refiere a fragmentos proteicos poliepitópicos, tales como aquellos de la proteína E6 de los papillomavirus humanos, su procedimiento de obtención, y sus utilizaciones, particularmente en el ámbito de la vacunación terapéutica o preventiva.

La invención tiene de una forma más particular como objetivo la utilización de fragmentos poliepitópicos de una proteína determinada para la preparación de medicamentos destinados a la prevención o al tratamiento de patologías en las cuales dicha proteína se reconoce por el sistema inmunitario celular.

Ventajosamente, dichos fragmentos poliepitópicos son tales que su aminoácido N-terminal corresponde al aminoácido N-terminal del epítopo situado en sentido ascendente de uno o varios otros epítopos de una región poliepitópica de dicha proteína, y su aminoácido C-terminal corresponde al aminoácido C-terminal del epítopo situado en sentido descendente del o de los epítopos anteriormente mencionados de dicha región poliepitópica.

De este modo, los fragmentos proteicos poliepitópicos anteriormente mencionados de la presente invención corresponden ventajosamente a las regiones poliepitópicas de una proteína determinada, a saber a las regiones que contienen varios epítopos reconocidos por las células T en asociación con las diferentes moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) , dichas regiones estando seleccionadas entre aquellas que tienen la característica de ser degradadas in vitro en péptidos más cortos a través de proteasomas, como el proteasoma 20S, cuando el fragmento proteico testado se pone en presencia de dicho proteasoma, particularmente según el método detallado siguiente. El fragmento proteico (aproximadamente 75 1g cuando se trata de un polipéptido de aproximadamente 30 aminoácidos) se incuba a 37°C con aproximadamente 151g de proteasoma 20S (Calbiochem Ref 539150, La Jolla, CA, EEUU) en 500 1l del tampón siguiente: 20 mM de Tris-HCl pH8, 0, 5 mM EDTA. Alícuotas de 50 1l son tomadas después del tiempo de incubación de 24 y 48 horas, y se analizan por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) . Los productos de digestión de los proteasomas se separan por RP-HPLC (Perkin Elmer) utilizando una columna C18 y un gradiente de acetonitrilo (de 0 a 100 % que contiene 0, 1 % de ácido trifluoroacético, en 90 mn, índice de elución 0, 8 ml/mn) . Los productos de división se detectan a 214 nm por un detector de absorción (759A, Applied Biosystems) .

Ventajosamente las regiones poliepitópicas definidas arriba poseen la característica de contener aminoácidos hidrófobos.

Los diferentes epítopos de la región poliepitópica de la proteína determinada, y delimitando los fragmentos proteicos poliepitópicos, son ventajosamente seleccionados entre los péptidos;

- ligándose a una molécula determinada del CMH, particularmente a una molécula de tipo HLA determinado, y esto hasta concentraciones de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-10 M en péptido para unas concentraciones de aproximadamente 10-7 M en molécula HLA, particularmente en las condiciones descritas más adelante,

- y formando un complejo estable con esta molécula del CMH, a saber particularmente un complejo en el cual dicho péptido queda ligado a dicha molécula durante al menos aproximadamente 3 horas a 37°C.

A título de ilustración, los epítopos anteriormente mencionados de la invención son seleccionados entre los péptidos susceptibles:

- por una parte de asociarse con las moléculas del CMH, particularmente por puesta en marcha del método siguiente: . incubación (particularmente durante aproximadamente 2 horas a 25°C, luego aproximadamente 15 horas a 4°C) del péptido en presencia de moléculas del CMH, provenientes de la lisis de células humanas o animales, o purificadas particularmente por cromatografía de afinidad a partir de líneas celulares humanas o animales, . atrapamiento de los complejos formados en el momento de la etapa precedente en un soporte sólido recubierto de un primer anticuerpo, particularmente monoclonal, reconociendo específicamente las moléculas del CMH en su conformación dependiente de su enlace a dicho péptido, . adición sobre el soporte sólido precedente de un segundo anticuerpo marcado, particularmente por acoplamiento a un marcador radioactivo, enzimático o fluorescente, dicho anticuerpo marcado reconociendo específicamente sea las cadenas pesadas del CMH en su conformación dependiente de su enlace al péptido, sea la cadena ligera del CMH o la º2microglobulina ligándose específicamente a las diferentes cadenas pesadas del CMH en su conformación mencionada, . detección, después de enjuague del soporte sólido, de la eventual presencia del segundo anticuerpo marcado que ha quedado fijado sobre el soporte sólido, demostrando un efecto de asociación entre las moléculas del CMH y el péptido estudiado,

- y, por otra parte, de formar un complejo con dichas moléculas del CMH, cuya estabilidad se puede evaluar por puesta en marcha de un método de seguimiento en el tiempo del enlace establecido entre el péptido y las moléculas del CMH, este

método siendo ventajosamente efectuado según un protocolo idéntico al método precedente, pero en el cual la etapa de incubación del péptido en presencia de las moléculas del CMH sobre el soporte sólido recubierto de dicho primer anticuerpo, es precedido por una etapa previa de eliminación del péptido libre susceptible de estar presente en el medio reactivo, particularmente por enjuague del soporte sólido, dicha etapa de incubación siendo efectuada (ventajosamente a una temperatura de 37°C) durante tiempos variables de 1h, 3h, 5h, 24h y 48h.

Como se ha mencionado más arriba, los epítopos de la invención deben ser reconocidos por las células T en asociación con las moléculas del CMH y asociarse a estas últimas, particularmente en el marco de la puesta en marcha de la prueba de reconocimiento descrita arriba. Esta asociación puede ser débil (detectable a concentraciones en análogos peptídicos del orden de 10-4 a 10-5 M) , intermedia (detectable a concentraciones en análogos peptídicos del orden de 10-6 a 10-7 M) , o fuerte (detectable a concentraciones en análogos peptídicos del orden de 10-8 a 10-9 M) . Los péptidos asociados a las moléculas del CMH en el marco de la presente invención son de preferencia susceptibles de ligarse durante al menos aproximadamente 3 horas en dichas moléculas del CMH.

La invención tiene más particularmente como objeto los epítopos (de nuevo designados péptidos más arriba y a continuación) tal como se han descrito arriba y caracterizados por el hecho de que son seleccionados entre aquellos susceptibles:

- de inducir in vitro la citólisis a través de linfocitos T citotóxicos, de células diana que presentan en su superficie el péptido anteriormente mencionado asociado a las moléculas del CMH, dichos linfocitos T citotóxicos estando ventajosamente tomados en un paciente padeciendo una patología en la cual está implicado el péptido estudiado,

- y de inducir in vitro la secreción de citoquinas (o interleuquinas) por los linfocitos T citotóxicos anteriormente mencionados, particularmente IL-2, IL-4 o el interferón y.

Llegado el caso, los epítopos anteriormente mencionados son elegidos entre aquellos capaces de inducir in vitro la aparición y el crecimiento de linfocitos T citotóxicos a partir de células humanas o animales, particularmente a partir de células mononucleadas provenientes de la sangre periférica (PBMC) , en presencia de factores necesarios para el crecimiento y la diferenciación de las células T citotóxicas.

Los fragmentos proteicos poliepitópicos de la invención están aún más caracterizados por el hecho de que son susceptibles de contener los epítopos CD4 reconocidos por las células T auxiliares en asociación con las moléculas del CMH de clase II, esta propiedad favoreciendo la inducción y el mantenimiento de las células T CD8+ reconociendo los epítopos comprendidos en dichos fragmentos.

La presente invención se ilustra con ayuda de la figura 1 representando la secuencia peptídica de la proteína E6 de la cepa 16 de los papillomavirus humanos (HPV 16) , así como los fragmentos poliepitópicos de la invención, y los... [Seguir leyendo]

1. Utilización de fragmentos poliepitópicos que contienen 6 epítopos de la proteína E6 de HPV, elegidos entre aquellos que incluyen:

- el fragmento que contiene 6 epítopos delimitados por los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o en las posiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6, este último fragmento estando caracterizado por la secuencia peptídica siguiente:

(46) RREVYDF AFRDLCIVYRDGNPY (67) dicho fragmento conteniendo los péptidos, cada péptido ligándose de manera estable a una al menos de las moléculas HLA de tipo A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los siguientes:

- (46) RREVYDFAFR (55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

- (49) VYDFAFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

- (50) YDFAFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

- (52) FAFRDLCIV (60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7;

- (54) FRDLCIVYR (62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

- (59) IVYRDGNPY (67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11 y las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados,

- por sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o

- por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o

- por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormente mencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos o pseudopéptidos, cada péptido ligándose específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellas ligándose a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de los cuales éstas derivan, para la preparación de un medicamento o vacuna destinado a la prevención o al tratamiento de patologías ligadas a la infección de individuos por los papillomavirus humanos; tales como las neoplasias cervicales intraepiteliales (CIN) , el cáncer invasivo del cuello del útero, las neoplasias vulvares intraepiteliales (VIN) .

2. Utilización de fragmentos poliepitópicos según la reivindicación 1 caracterizada por el hecho de que el número de aminoácidos de la secuencia peptídica de dichos fragmentos es superior o igual a 17 e inferior o igual a 30.

3. Utilización de fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 de HPV según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por el hecho de que dicho fragmento contiene 6 epítopos, cada epítopo ligándose de manera estable a una al menos de las 10 moléculas HLA de los tipos sucesivos: A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los sucesivos:

- (46) RREVYDFAFR (55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

- (49) VYDFAFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

- (50) YDFAFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

- (52) FAFRDLCIV (60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7;

- (54) FRDLCIVYR (62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

- (59) IVYRDGNPY (67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11.

4. Fragmentos poliepitópicos que contienen 6 epítopos de la proteína E6 de HPV, elegidos entre aquellos que incluyen:

- el fragmento que contiene 6 epítopos delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o en las posiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6, este último fragmento estando caracterizado por la secuencia peptídica siguiente:

(46) RREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (67) dicho fragmento conteniendo los péptidos, cada péptido ligándose de manera estable a una al menos de las moléculas HLA de tipo A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, y

- las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados,

- por sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o

- por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o

- por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormente mencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos o pseudopéptidos ligándose específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellas ligándose a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos mencionados arriba de los cuales éstas derivan.

5. Fragmentos poliepitópicos según la reivindicación 4 caracterizados por el hecho de que el número de aminoácidos de la secuencia peptídica de dichos fragmentos es superior o igual a 17 e inferior o igual a 30.

6. Fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 de HPV según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, dicho fragmento conteniendo 6 epítopos, cada epítopo ligándose de manera estable a una al menos de las 10 moléculas HLA de los tipos siguientes: A2, A3, A11; A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los siguientes:

- (46) RREVYDFAFR (55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

- (49) VYDFAFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

- (50) YDF AFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

- (52) FAFRDLCIV (60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7,

- (54) FRDLCIVYR (62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

- (59) IVYRDGNPY (67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11.

7. Secuencias nucleótidas que codifican para un fragmento poliepitópico o para una secuencia peptídica derivada según la reivindicación 4.

8. Anticuerpos, policlonales o monoclonales, dirigidos contra un fragmento poliepitópico o contra una secuencia peptídica derivada según la reivindicación 4.

9. Composición farmacéutica, o vacuna, caracterizada por el hecho de que comprende: a)

- al menos un fragmento poliepitópico de la proteína E6 definido en la reivindicación 4,

- y/o al menos una secuencia peptídica derivada de este fragmento, tal y como se define en la reivindicación 4,

- y/o al menos un vector apropiado, particularmente de los lipopéptidos y/o micelas, que contiene al menos un fragmento poliepitópico anteriormente mencionado de la proteína E6, y/o al menos una secuencia derivada mencionada de estos fragmentos, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable, dicho fragmento proteico poliepitópico y/o su secuencia derivada estando en su caso asociados a uno o varios otros epítopos exógenos reconocidos a través de células T auxiliares, tales como el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 830 y 846 de la secuencia peptídica de la toxina tetánica, la hemaglutinina, o el epítopo PADRE,

o b)

- al menos una secuencia nucleótida según la reivindicación 7, codificando para un fragmento poliepitópico anteriormente mencionado de la proteína E6,

- y/o al menos una secuencia nucleótida codificando para una secuencia peptídica derivada de este fragmento, tal y como está definido arriba,

- y/o al menos un vector apropiado anteriormente mencionado, elegido particularmente entre el virus, que contiene al menos una secuencia nucleótida mencionada, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable,

o c)

- anticuerpos según la reivindicación 8, dirigidos contra un fragmento poliepitópico de la proteína E6, y/o contra una secuencia peptídica derivada de estos fragmentos, tal como se define arriba.

10. Epítopos de la proteína E6 de HPV elegidos entre los siguientes:

- (46) RREVYDFAFR (55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

- (50) YDFAFRDL (57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, B44,

- (54) FRDLCIVYR (62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, A11.