Un polinucleótido que codifica una proteína cápsida L1 de HPV-11 en el que la región 3'' no traducida del ARNm transcrito de la misma no contiene la secuencia AUUUA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de forma general al papilomavirus (PV). Más particularmente, la invención se refiere a un método de expresar la secuencia codificante de proteína de cápside del papilomavirus humano de tipo 11 (HPV-11) usando el sistema de expresión en baculovirus, la producción de partículas de tipo virus (VLP) de HPV y el uso de estas VLP para el desarrollo de la vacuna de HPV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La familia Papovaviridae constituye un grupo de virus de ADN que inducen tanto infecciones líticas como tumores benignos o malignos. Estructuralmente, todos son viriones icosaédricos desnudos con 72 capsómeros y contienen ADN circular bicatenario. Los virus incluidos en la familia son: (1) papilomavirus humanos y animales, (2) poliomavirus de ratón, (3) virus vacuolantes de simio y (4) virus BK y JC humanos.

Los papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelios cutáneo, genital, oral y respiratorio de un modo específico de tejido. La infección por HPV se ha asociado estrechamente con el desarrollo tanto de lesiones benignas como de neoplasias malignas (Reichman et al., Papillomaviruses, 1990, págs. 1191-1200; y Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3ª Edición, Churchill Livingstone, New York, N.Y.). Por ejemplo, el HPV de tipo 1 (HPV1) está presente en verrugas plantares, los HPV de tipo 6 u 11 (HPV-6 o HPV-11) en condylomata acuminata (verrugas anogenitales), mientras que el HPV de tips 16 ó 18 (HPV-16 ó HPV-18) son comunes en lesiones premalignas y malignas del epitelio escamoso cervical (véase Crum et al., “Human papillomavirus infection and cervical neoplasia: New perspectives,” 1984, Int. J. Gynecol. Pathol., vol. 3, págs. 376-388; zur Hausen, Genital Papillomavirus Infections, 1985, págs. 83-90; Rigby et al., Viruses and Cancer, Cambridge University Press, Cambridge, UK; y Koutsky et al., “Epidemiology of genital human papillomavirus infection,” 1988, Epidemiol. Rev., vol. 10, págs. 122-163).

Sin embargo, las dificultades en la propagación del HPV in vitro ha conducido al desarrollo de estrategias alternativas para la producción de antígenos para estudios inmunológicos. Por ejemplo, Bonnez et al., “The PstI-XhoII restriction fragment of the HPV-6b L1 ORF lacks immunological specificity as determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and controls,” 1990, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Series, vol. 124, págs. 77-80; Jenison et al., “Identification of immunoreactive antigens of human papillomavirus type 6b by using Escherichia coli-expressed fusion proteins,” 1988, J. Virol., vol. 62, págs. 2115-2123; Li et al., “Identification of the human papillomavirus type 6b L1 open reading frame protein in condylomas and corresponding antibodies in human sera,” 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 26842690; Steele et al., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1,” 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398; and Strike et al., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the 'common antigen,” 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, han expresado secuencias codificantes de proteína de cápside recombinante en sistemas procariotas y usado las mismas en análisis de transferencia de Western de sueros obtenidos de individuos con infección de HPV del tracto genital. Los resultados de estos estudios han sugerido que los anticuerpos para epítopos desnaturalizados, es decir lineales de proteínas de cápside de HPV se pueden detectar en los sueros de algunos individuos infectados.

Las partículas de virus completo también se han usado para detectar anticuerpos en sueros humanos, incluyendo anticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Estos estudios han sido difíciles de realizar debido a que la mayoría de las lesiones inducidas por HPV que tiene origen natural producen pocas partículas. Sin embargo, las partículas de virus completas se pueden obtener en cantidades suficientes para realizar ensayos inmunológicos de verrugas plantares inducidas por HPV de tipo 1 (Kienzler et al., “Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts,” 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 65-672; “Pfister et al., Seroepidemiological studies of human papilloma virus (HPV-1) infections,” 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs. 161-165; y Steele et al., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1,” 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398) y xenoinjertos de ratón actínico de HPV-11 inducido experimentalmente (Kreider et al., “Laboratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11,” 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593; y Kreider et al., “Morphological transformation in vivo of human uterine cervix with papillomavirus from condylomata acuminata,” 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641). Más particularmente, la Patente de Estados Nº

5.071.757 de Kreider et al., describe un método de propagación de viriones de HPV-11 infecciosos en el laboratorio usando un sistema de modelo de xenoinjerto de ratón atímico. Aunque este sistema es capaz de producir cantidades de virus infecciosos que se podrían usar para el desarrollo de un ensayo serológico para la infección por HPV genital, este sistema es muy costoso y engorroso. Además, hasta ahora solamente un tipo de HPV genital se ha propagado en ese sistema, por tanto, limitando su utilidad. Además, el virus infeccioso producido usando este sistema representa un riesgo biológico y, por lo tanto, sería difícil de usar una formulación de vacuna.

Zhou et al., en “Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles”, 1992, Virology, vol. 185, págs. 251-257, han descrito la formación de partículas de tipo virus de HPV-16 en núcleos de células CV-1 después de la infección por un vector de expresión recombinante doble de L1/L2 de HPV-16 de virus vaccinia. Sin embargo, los autores no fueron capaces de producir las VLP con un vector que exprese solamente L1. Además, las VLP producidas carecían de una simetría bien definida y eran más viables en tamaño y menores, solamente de aproximadamente 35-40 nm de diámetro que los viriones de HPV (55 nm) o las VLP de la presente invención (las VLP de HPV-11 producidas por baculovirus, de aproximadamente 50 nm de diámetro.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.045.447, de Minson, describe un método de exploración de sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos monoclonales con especificidades deseadas. El método de Minson se ilustra mediante la producción de anticuerpos para la proteína L1 del papilomavirus de tipo 16 (HPV-16) usando esta proteína como el antígeno diana en ratones. Sin embrago, Minson no consigue describir la expresión de la proteína L1 o la producción de partículas de tipo virus (VLP) de HPV.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.777.239, de Schoolnik et al., describe secuencias peptídicas cortas obtenidas de varias de las fases de lectura abierta de la región temprana de papilomavirus que provocan anticuerpos específicos de tipo para papilomavirus. Sin embargo, los inventores no consiguen describir ninguna secuencia dirigida a la fase de lectura abierta tardía principal L1.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.057.411 de Lancaster et al., describe una secuencia polinucleotídica de aproximadamente 30 nucleótidos de la fase de lectura abierta de la proteína de cápside L1 de papilomavirus que los inventores afirman que codifica un epítopo específico de tipo de papilomavirus. Sin embargo, los inventores no describen animales infectados que produzcan anticuerpos que reconozcan esta secuencia. En lugar de esto, sintetizaron una versión de papilomavirus bovino de tipo 1 (BPV-1) de la secuencia (un péptido de 10 aminoácidos o decapéptido), después inmunizaron conejos y ensayaron la capacidad del antisuero de reaccionar con tejido de fibropapiloma inducido con BPV-1 o BPV-2. El antisuero peptídico reaccionó solamente con tejido de BPV-1 y no BPV-2. Después, los inventores llegaron a la conclusión de que el péptido contenía un determinante antigénico que era específico de tipo y, por lo tanto, todas las secuencias codificantes de L1 de papilomavirus contenían un epítopo específico de tipo en este locus. Esto es una...

1. Un polinucleótido que codifica una proteína de cápside L1 del HPV-11, en el que la región no traducida 3' del ARNm transcrito del mismo no contiene la secuencia AUUUA en los 30 nucleótidos del codón de terminación de la secuencia codificante de L1.

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región no traducida 3' del ARNm transcrito del mismo no contiene la secuencia AUUUA.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho ARNm no contiene la secuencia AUUUA en los 30 nucleótidos del codón de terminación de la secuencia codificante de L1.

4. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación

2.

5. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4, que es un vector de expresión de baculovirus.

6. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.

7. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 5, en el que la célula hospedadora es una célula de insecto.

8. Un método para producir una partícula de tipo virus o un capsómero del papilomavirus humano, comprendiendo el método cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 y obtener dicha partícula de tipo virus o capsómero de la misma.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la proteína de cápside L1 se expresa a partir de una secuencia que codifica a la proteína L1 que produce una proteína o un complejo proteico que posee características inmunológicas y morfológicas similares a las del papilomavirus nativo en el que dicha partícula o capsómero puede reconocer anticuerpos en sueros humanos procedentes de personas que se sabe que están infectadas por un virus homólogo.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 en el que dicha partícula de tipo virus o capsómero está purificado.

11. Un método para producir una vacuna contra el papilomavirus humano, comprendiendo el método obtener una partícula de tipo virus o un capsómero del papilomavirus humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 y la combinación de esta con un adyuvante.

12. Un método para producir una combinación de partículas de tipo virus del papilomavirus humano, comprendiendo el método la producción de una partícula de tipo virus del papilomavirus humano que comprende una proteína de cápside L1 del HPV-11 de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y la combinación con una o más partículas de tipo virus que comprenden una proteína L1 procedente de uno o más papilomavirus humanos diferentes.

13. Un método para producir una vacuna polivalente contra los papilomavirus humanos, comprendiendo el método

obtener una combinación de partículas de tipo virus del papilomavirus humano de acuerdo con la reivindicación 12 y la combinación de estas con un adyuvante.