Expresión de proteínas virales en las plantas.

Un método para producir polipéptidos L1 del HPV en una planta que comprende las etapas de:

- clonación de un gen para L1 del HPV o un ácido nucleico que codifica un equivalente funcional en un vector adaptado para dirigir un polipéptido expresado en el citoplasma a los cloroplastos presentes en la planta;

- infiltrar al menos una porción de la planta con el vector o transformar tejido de la planta con el vector para expresar transitoriamente los polipéptidos L1 del HPV en el citoplasma y luego importar los polipéptidos L1 del HPV en los cloroplastos y / o para crear una planta transgénica en donde los polipéptidos L1 del HPV se expresan en el citoplasma y luego se importan en los cloroplastos; y

- recuperar el polipéptidos L1 del HPV expresados por la planta.

Expresión de proteínas virales en las plantas Antecedentes de la invención Esta invención se relaciona con la expresión de proteína en las plantas. En particular, la presente invención se relaciona con un método de expresión de proteína transgénica y localización intracelular para la producción de proteínas con alto rendimiento. Esta invención se relaciona también con la producción de proteína del virus del papiloma humano (VPH) en una planta. Esta invención se relaciona además con un mecanismo rápido para evaluar la expresión de proteínas en las plantas.

El uso de plantas transgénicas para la producción a gran escala de proteínas heterólogas está ganando gradualmente gran aceptación, y podría ser una plataforma para la producción rentable de proteínas para vacunas. La generación de plantas transgénicas para investigar las características de expresión de una gran variedad de proteínas y/o vectores de expresión no siempre es viable debido a lo demorado de este proceso. Por el contrario, los sistemas de expresión transitoria son capaces de evaluar rápidamente la expresión de proteínas de una variedad de diferentes proteínas en una variedad de especies de plantas.

Otro problema relacionado con el uso de plantas transgénicas para producción a gran escala de proteínas son en general los niveles decepcionantemente bajos de proteína heteróloga producida. Los plastos de la planta, especialmente los cloroplastos, han sido transformados exitosamente con vectores recombinantes que expresan proteína heteróloga para aumentar significativamente los niveles de proteína producidos por la proteína soluble total en la planta (véase, por ejemplo, WO2005/011367 y WO2004/005467A2) . Los plastos son también capaces de importar una variedad de moléculas, incluyendo proteínas. Existen diferentes procesos a través de los cuales ocurre esto, uno de los cuales implica la interacción con la membrana del tilacoidal del plástido. El direccionamiento de proteínas heterólogas hacia el plástido es un mecanismo para incrementar significativamente la acumulación de proteína dentro de la célula vegetal.

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium ha sido utilizada durante muchos años para generar plantas transformadas en forma estable. Este método implica la transferencia del complejo T (un complejo formado con el ADN-T agrobacteriano y los productos génicos de virulencia) de cepas de Agrobacterium a células vegetales (Zupan et al., 2000) . Cualquier ADN situado entre las repeticiones directas de 25 pb (bordes izquierdo y derecho) que delimitan al ADN-T monocatenario es transferido al núcleo de la célula vegetal (Zupan et al., 2000) , donde se integra en el cromosoma de la planta a través de recombinación ilegítima (Somers y Makarevitch, 2004) . Muchas de las copias de ADN-T presentes en el núcleo no se integran, pero consiguen ser transcritas, provocando expresión transitoria. La expresión transitoria no se ve afectada por el efecto de la posición, y puede producir niveles dramáticamente más altos de proteína foránea que la transformación estable (Kapila et al., 1997) .

Dos métodos de infiltración de Agrobacterium (agroinfiltración) se utilizan comúnmente: infiltración por inyección e infiltración al vacío. La inyección de Agrobacterium consiste en la inyección directa en los espacios aéreos abaxiales de una hoja, mientras que la hoja está todavía unida a la planta (Voinnet et al., 2003) . Durante la infiltración al vacío se aplica un vacío a una suspensión agrobacteriana en el que las hojas están sumergidas (Kapila et al., 1997) . Aunque normalmente se realiza en tan sólo unas pocas hojas, esta técnica se puede ampliar: Los investigadores de Medicago Inc. (Quebec, Canadá) son capaces de agroinfiltrar hasta 7500 hojas de alfalfa por semana, y Stefan Schillberg y sus colegas (Instituto de Biotecnología Molecular, RWTH Aachen, Alemania) han agroinfiltrado hasta 100 kg de hojas de tabaco (Twyman 2004) .

La expresión transitoria mediada por Agrobacterium alcanza su máximo a las 60 a 72 horas después de la infiltración, y luego disminuye drásticamente como resultado de silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) (Voinnet et al., 2003) . El PTGS o la interferencia de ARN es una respuesta adaptativa de defensa antiviral que limita la replicación y propagación del virus en las plantas. Este proceso implica el reconocimiento de un ARN objetivo y la iniciación de una vía de degradación de ARN específica de la secuencia el citoplasma (Voinnet, 2001) . Ciertos virus vegetales codifican supresores de silenciamiento que tienen la capacidad para inhibir el PTGS. Algunas de estas proteínas supresoras del silenciamiento, tales como NSs del virus del marchitamiento moteado del tomate (TSWV) (Takeda et al., 2002) , y el virus de la atrofia del follaje del tomate p19 (Voinnet et al., 2003) han sido utilizadas para prolongar y aumentar la expresión transitoria mediada por Agrobacterium por medio de la infiltración conjunta de Agrobacterium que contiene un gen supresor del silenciamiento.

Existe la necesidad de optimizar la expresión de proteínas comercialmente viables en las plantas hasta niveles que harían de las plantas una plataforma viable. En particular, existe la necesidad de un método para producir proteína del HPV en una planta.

También existe la necesidad por vectores, plantas transgénicas o partes de las mismas y por la progenie de tales plantas para satisfacer la necesidad descrita anteriormente.

Resumen de la invención De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir polipéptidos L1 del HPV en una planta que comprende las etapas de:

1. clonación de un gen para L1 del HPV o ácido nucleico que codifica un equivalente funcional en un vector adaptado para dirigir un polipéptido expresado en el citoplasma a los cloroplastos presentes en la planta;

2. infiltrar al menos una porción de la planta con el vector o el tejido transformador de la planta con el vector para expresar transitoriamente los polipéptidos L1 del HPV en el citoplasma y luego importar los polipéptidos L1 del HPV en los cloroplastos y/o para crear una planta transgénica en donde los polipéptidos L1 del HPV se expresan en el citoplasma y luego se importan en los cloroplastos; y

3. recuperar los polipéptidos L1 del HPV expresados por la planta.

El término "planta" pretende abarcar todos los organismos vivos que carecen de órganos sensoriales especializados y el poder de movimientos voluntarios. Como tal, la definición incluye tanto monocotiledóneas y las dicotiledóneas y todos los organismos fotosintetizadores.

El término "polipéptidos del HPV" pretende abarcar a la proteína L1 del VPH; un péptido quimérico L1 del VPH fusionado a otro péptido antigénico del VPH; un péptido quimérico L1 del VPH fusionado a un péptido heterólogo derivado de cualquier epítopo antigénico, proteína específica de células B o de células T y una proteína L2 del VPH

o sus equivalentes funcionales. Lo mismo aplica, cambiando lo que haya que cambiar, al término 'gen del VPH'.

El término "componentes de la planta" pretende abarcar plastos, retículos endoplasmáticos, el citoplasma y apoplastos. Preferiblemente, el componente de la planta es un plástido.

Por direccionamiento se pretende que se puedan incluir en el vector secuencias objetivo. Tales secuencias objetivo pueden ser traducidas en un péptido que dirige al vector o al producto del mismo al componente deseado en la planta, tal como un plástido.

El vector de acuerdo con la presente invención incluye preferiblemente promotores y otros reguladores necesarios, tales como terminadores o similares operativamente enlazados a la secuencia de codificación.

Se apreciará que infiltrar por lo menos una porción de la planta con el vector puede dar lugar a la expresión transitoria de la proteína y la transformación del tejido de la planta con el vector para crear una planta transgénica puede dar lugar a la expresión transgénica de la proteína, ambas de cuyas formas de expresión se contempla que caigan dentro del ámbito de la presente solicitud.

En esta memoria la referencia a una proteína, un péptido o a un gen o sus equivalentes funcionales incluye referencias variantes de las mismas que son capaces de llevar a cabo en gran parte la misma función que la proteína, el péptido, el polipéptido o el gen. Preferiblemente, esta invención se relaciona con la producción de la proteína L1 del HPV-16; un péptido quimérico... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir polipéptidos L1 del HPV en una planta que comprende las etapas de:

- clonación de un gen para L1 del HPV o un ácido nucleico que codifica un equivalente funcional en un vector adaptado para dirigir un polipéptido expresado en el citoplasma a los cloroplastos presentes en la planta;

- infiltrar al menos una porción de la planta con el vector o transformar tejido de la planta con el vector para expresar transitoriamente los polipéptidos L1 del HPV en el citoplasma y luego importar los polipéptidos L1 del HPV en los cloroplastos y / o para crear una planta transgénica en donde los polipéptidos L1 del HPV se expresan en el citoplasma y luego se importan en los cloroplastos; y

- recuperar el polipéptidos L1 del HPV expresados por la planta.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde los polipéptidos L1 del HPV se seleccionan de entre el grupo que consiste de una proteína L1 del HPV; un péptido quimérico L1 del VPH fusionado a otro péptido antigénico del HPV; un péptido quimérico L1 del HPV fusionado a un péptido heterólogo derivado de cualquier epítopo antigénico, específico de células B o de células T, o sus equivalentes funcionales.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las secuencias objetivo que codifican un polipéptido para dirigir al polipéptido L1 del HPV dese el citoplasma hasta el cloroplasto están incluidas en el vector.

4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde el vector incluye promotores y otros reguladores o similares enlazados operativamente a la secuencia de codificación del vector.

5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde los vectores son vectores binarios.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 en donde los vectores son vectores binarios de Agrobacterium tumefaciens.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 en donde el gen para L1 del HPV; el gen quimérico para L1 del HPV fusionado a otro gen para el antígeno del HPV; o un gen quimérico para L1 del HPV fusionado a un gen heterólogo derivado de cualquier epítopo antigénico, específico de células B o de células T, es un gen optimizado para uso del codón.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 en donde el gen optimizado humano es optimizado por un codón humano, optimizado por un codón de BCG u optimizado por un codón de la planta.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 en donde el gen para L1 del HPV o los genes de las quimeras L1 del HPV son modificados para ser deficientes en la señal de localización nuclear.

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que incluye la etapa de infiltración conjunta de la planta con una proteína supresora adaptada para inhibir el silenciamiento post-transcripcional del gen en una planta.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 en donde la proteína supresora es la proteína NSs del virus del marchitamiento moteado del tomate o el p19 del virus de la atrofia del follaje del tomate.

12. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que incluye además la etapa de infiltración conjunta de la planta con un gen para L2 del HPV.

13. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde la infiltración se realiza mediante inyección directa o por vacío.

14. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde la infiltración y / o transformación de la planta se logra con Agrobacterium tumefaciens que ha sido transformado para aceptar el vector.

15. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde la planta se selecciona de entre Nicotiana benthamiana y N. tabacum.

16. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde la infiltración se lleva a cabo sobre las hojas de la planta.

17. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde la infiltración por inyección directa se

realiza sobre la región abaxial de la hoja.

18. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde el gen para L1 del HPV o el ácido nucleico que codifica un equivalente funcional se selecciona a partir de las secuencias mostradas en las Figuras 2 y 3.

19. Un método para producir un polipéptido L1 del HPV en una planta en donde sustancialmente la planta completa se infiltra con un vector adecuado por medio de infiltración al vacío.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en donde el vector se adapta a los cloroplastos objetivo presentes en la planta provocando que un polipéptido expresado incluya una porción capaz de interactuar con las membranas tilacoidales de los cloroplastos.

21. El uso de un vector en el cual se ha clonado un gen para L1 del HPV, en donde el vector se adapta a los cloroplastos objetivo presentes en una planta para expresar ya sea en forma transitoria un polipéptido L1 del HPV en el citoplasma y luego importar el polipéptido del HPV dentro de los cloroplastos y/o para crear una planta transgénica donde el polipéptido L1 del HPV se expresa en el citoplasma y luego se importa dentro de los cloroplastos.

22. El uso de acuerdo a la reivindicación 21 en donde el vector se adapta a cloroplastos objetivo presentes en la planta provocando que un polipéptido expresado incluya una porción capaz de interactuar con las membranas tilacoidales de los cloroplastos.

23. Un vector dentro del cual se ha clonado un gen para L1 del HPV, en donde el vector se adapta a los cloroplastos objetivo presentes en una planta para expresar ya sea en forma transitoria un polipéptido L1 del HPV en el citoplasma y luego importar el polipéptido L1 del HPV dentro de los cloroplastos y/o para crear una planta transgénica donde el polipéptido L1 del HPV se expresa en el citoplasma y luego se importa dentro de los cloroplastos.

24. Un vector de acuerdo con la reivindicación 23 en donde el vector se adapta a los cloroplastos objetivo presentes en la planta provocando que un polipéptido expresado incluya una porción capaz de interactuar con las membranas tilacoidales de los cloroplastos.

25. Una planta transgénica, una parte o progenie de la misma que contiene una célula transformada con un vector adaptado a los cloroplastos objetivo presentes en la planta y que codifica un gen para L1 del HPV o ácido nucleico que codifica un equivalente funcional del mismo, de tal manera que un polipéptido L1 del HPV se exprese en el citoplasma y luego se importa dentro de los cloroplastos.

26. Una planta transgénica, una parte o progenie de la misma de acuerdo con la reivindicación 25 en donde el vector se adapta a los cloroplastos objetivo presentes en la planta provocando que un polipéptido expresado incluya una porción capaz de interactuar con las membranas tilacoidales de los cloroplastos.