Vector de alta expresión constitutivamente estable para preparar vacuna contra el VPH y bacterias de ácido láctico recombinante transformadas de ese modo.

Un vector de expresión de superficie para preparar vacunas para el virus del papiloma humano (VPH),

comprendiendo el vector de expresión de superficie un gen que codifica una proteína mutante repE con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1, un activador, un gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa para la expresión de superficie y un gen que se liga con el gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa y codifica una proteína antígeno asociada por inducción a tumor de virus del papiloma humano.

Vector de alta expresión constitutivamente estable para preparar vacuna contra el VPH y bacterias de ácido láctico recombinante transformadas de ese modo.

Campo técnico La presente invención se refiere a un vector de expresión de superficie para preparar vacunas terapéuticas contra el VPH, en que el vector de expresión de superficie contiene un gen que codifica una proteína mutante repE que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1, un activador, un gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa y un gen que se liga con el gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa y codifica una proteína antígeno asociada por inducción a tumores de virus del papiloma humano.

Antecedentes Se sabe que la producción de proteínas extrañas útiles en intentos para expresar grandes cantidades de las proteínas extrañas depende del número de copias de los genes, esto es, el número de plásmidos y la concentración de activadores que se usan para controlar la transcripción. Se indicó que la expresión de proteínas diana se puede aumentar cambiando el número de vectores plásmido en bacterias individuales, además de activadores de alta expresión que se usan convencionalmente con frecuencia (Tomio, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 28: 170, 1.988) . También, se indicó que las mutaciones de RepE en el plásmido mini-F pueden cambiar el número de 25 plásmidos en bacterias individuales (Yasuo, K. et al., J. Biol. Chem., 267: 11.520, 1.992) .

Se estima que el virus del papiloma humano (VPH) infecta a más del 50% de los adultos en el mundo. En particular, se indicó que cuatro tipos de VPH incluyendo VPH 16, 18, 31 y 45 causan más del 80% de los casos de cáncer cervical (Lowy, D. R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 91: 2.436, 1.994) .

El cáncer cervical es el segundo cáncer más común en la mujer a continuación del cáncer de mama y según la OMS (Organización Mundial de la Salud) , se estima que tienen lugar más de 500.000 nuevos casos de cáncer cervical en el mundo cada año y más de 300.000 pacientes en el mundo cada año mueren de cáncer cervical. Especialmente en los países en desarrollo, el cáncer cervical es una causa principal de muerte en la mujer (Pisani, P. et al., Int. J. Cancer, 55: 891, 1.993) . El informe de la IARC mostró que el número de pacientes por infección por VPH crónicos en los países en desarrollo es significativamente mayor que en los países avanzados y que la manera más eficaz para erradicar la infección por el VPH es administrar vacunas profilácticas contra el VPH.

El desarrollo de vacunas asociadas al cáncer cervical se ha centrado en dos tipos de vacunas profilácticas y vacunas terapéuticas. Las vacunas profilácticas pretenden producir un anticuerpo de neutralización más fuerte por antígeno L1/L2 de VPH, evitando así un huésped de infección por VPH y evitando que la enfermedad progrese más, incluso si ya está infectado. Por otra parte, la vacuna terapéutica fija como objetivo E6/E7 de VPH y pretende inducir inmunorespuestas celulares específicas para degenerar lesiones formadas o tumores malignos.

Debido a que la proteína E6/E7 de VPH es un antígeno específico del cáncer asociado a la carcinogénesis de células infectadas por VPH, se han continuado los estudios sobre el uso de la proteína E6/E7 como una diana para inmunoterapia de cáncer cervical. Por supuesto, hay un informe de que cuando se administró una proteína E6/E7 de VPH en un sistema microbiano a ratones a los que se inyectaron células tumorales, se inhibió o retardó la formación de tumores (Gao, L. et al., J. Gen. Viol., 75: 157, 1.994, Meneguzzi, G. et al., Virology, 181: 62, 1.991) . Sin embargo, en el caso en que se usen vacunas de virus vivos, pueden surgir problemas asociados a una excesiva replicación vírica, similar a otros casos. Así, las vacunas de virus vivos se usan sólo para fines de investigación en muchos casos y presentan desventajas por que lleva un largo periodo de tiempo para que se comercialicen y requieren considerables estudios clínicos.

Mientras tanto, los estudios sobre el desarrollo de vacunas incluyendo vectores bacterianos también se han estado realizando activamente y hay un informe de que VLP de VPH 16 sintetizado en Salmonella typhimurium atenuado induce la producción de anticuerpos específicos del antígeno en la mucosa o el cuerpo completo de los ratones (Denis, N. et al., Infection and immunity, 65: 3.328, 1.997) . En el caso de vacunas que constan de péptidos sintéticos, sólo se sintetizan epítopos requeridos para inducir inmunorespuestas para vacunación y ya se han elucidado epítopos que causan respuestas a lifocito T citotóxico (CTL, por sus siglas en inglés) para E6/E7 de VPH 16 (Ressing, M. E. et al., J. Immunol., 154: 5.934, 1.995) .

Además de dichos intentos, se están realizando estudios sobre usar verduras transgénicas mismas (obtenidas de verduras incluyendo tomate y patata) como vacunas orales o vacunas comestibles para producir antígenos víricos en las plantas. Ejemplos específicos de las mismas incluyen partículas de antígeno de superficie de hepatitis B (Thavala Y. F. y Artzen, C. J., Pro. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 3.358, 1.995) y las proteínas L1 y L2 de la cápside de virus del papiloma (Patente Coreana Nº Registro 0366608) . Sin embargo, los sistemas vegetales presentan un problema por que el uso comercial de los mismos es limitado, debido a que la cantidad de proteína L1 de VPH expresada es pequeña y tienen lugar problemas asociados a la purificación.

La entrada de la base de datos recuperada de EBI nº de acceso UNIPROT: Q52249 describe el plásmido beta 1 de

pAM de Streptococcus faecalis (Enterococcus faecalis) .

El documento de patente internacional WO 2004/035795 describe vectores de expresión que pueden producir de manera eficaz la proteína de la cápside de virión, la proteína asociada a tumores de virus del papiloma humano, en una superficie microbiana y en cepas bacterianas que albergan dichos vectores indicadores de la superficie.

El documento Matsunaga F. et al.: "DNA-binding domain of the RepE initiator protein of mini-F plasmid: involvement of the carboxyl-terminal region.", Journal of Bacteriology, vol. 177, nº 8, 1 de abril de 1.995, páginas 1.994-2.001 describe que la proteína iniciadora RepE es esencial para la replicación de mini-F en Escherichia coli y presenta dos funciones principales, es decir, iniciación de replicación de ADN de ori2 y represión autógena de transcripción de repE.

Así, a la vista del hecho de que la población infectada por el VPH se concentra principalmente en los países en desarrollo, se requiere urgentemente el desarrollo de un método para preparar antígenos de VPH de una manera más económica y estable para prevenir y tratar los tumores procedentes de virus del papiloma en la mucosa de la piel de las cavidades orales u órganos genitales.

Los presentes autores desarrollaron previamente un vector para expresar de manera eficaz una proteína antígeno de VPH sobre la superficie de microrganismos recombinantes transformados y un método para expresar una proteína antígeno de VPH en la superficie de los microrganismos (Patente Coreana Nº Registro 0609866) .

De acuerdo con esto, los presentes autores han hecho grandes esfuerzos para desarrollar un vector capaz de expresar de una manera más estable y constitutivamente un alto nivel de una proteína antígeno de VPH en la superficie de bacterias de láctico ácido recombinante transformadas y, como resultado, han encontrado que la proteína antígeno de VPH se expresa de manera más estable en un nivel alto en microrganismos recombinantes transformados con un vector que contiene un gen mutante repE, completando se ese modo la presente invención.

Descripción de la invención Es un objeto principal de la presente invención proporcionar un vector capaz de expresar de manera estable y constitutivamente un alto nivel de una proteína antígeno de VPH en la superficie de bacterias de ácido láctico recombinantes transformadas usando un gen mutante repE.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar bacterias de ácido láctico recombinantes transformadas con dicho vector de expresión y un método para preparar la proteína antígeno de VPH usando dichas bacterias de ácido láctico.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una vacuna para tratar cáncer cervical, que comprende dichas bacterias de ácido láctico recombinantes transformadas.

Para conseguir los objetos anteriores, la presente invención proporciona un vector de expresión de superficie que contiene: un gen mutante repE que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; un activador; un gen de complejo poli-gamma-glutamato... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión de superficie para preparar vacunas para el virus del papiloma humano (VPH) , comprendiendo el vector de expresión de superficie un gen que codifica una proteína mutante repE con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1, un activador, un gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa para la expresión de superficie y un gen que se liga con el gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa y codifica una proteína antígeno asociada por inducción a tumor de virus del papiloma humano.

2. El vector de expresión de superficie según la reivindicación 1, en el que la proteína antígeno asociada por inducción a tumor de VPH es E7 o E7 (Rb) de VPH.

3. El vector de expresión de superficie según la reivindicación 1, en el que el activador es un activador de aldolasa procedente de bacterias de ácido láctico.

4. El vector de expresión de superficie según la reivindicación 1, en el que el gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa es seleccionado del grupo que consiste en pgsB, pgsC y pgsA.

5. Un microrganismo recombinante transformado con el vector según la reivindicación 1.

6. El microrganismo recombinante según la reivindicación 5, en el que el microrganismo es bacteria de ácido láctico.

7. Una vacuna para uso en el tratamiento de cáncer cervical, comprendiendo la vacuna el microrganismo recombinante transformado según la reivindicación 5 ó 6, como un ingrediente activo.

8. Un método para preparar un microrganismo que tiene un antígeno de VPH expresado en la superficie del mismo, comprendiendo el método las etapas de: cultivar el microrganismo recombinante según la reivindicación 5, para expresar un antígeno de VPH en la superficie del microrganismo y recoger el microrganismo recombinante que tiene el antígeno de VPH expresado en la superficie del mismo.

9. Una vacuna para uso en el tratamiento de cáncer cervical, comprendiendo la vacuna el microrganismo recombinante que tiene el antígeno de VPH expresado en la superficie del mismo preparado por el método según la reivindicación 8, como ingrediente activo.

10. La vacuna para uso según la reivindicación 7 ó 9, en la que la vacuna se administró por vía oral.

11. Un vector de expresión de superficie para preparar vacunas de VPH, comprendiendo el vector de expresión de superficie un gen que codifica una proteína mutante repE que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, un activador de aldolasa procedente de bacterias de ácido láctico, un gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa seleccionado del grupo que consiste en pgsB, pgsC y pgsA para expresión de superficie y un gen que se liga con el gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa y codifica una proteína E7 de antígeno asociado por inducción a tumor de virus del papiloma humano.

12. Un vector de expresión de superficie para preparar vacunas de VPH, comprendiendo el vector de expresión de superficie un gen que codifica una proteína mutante repE que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, un activador de aldolasa procedente de bacterias de ácido láctico, un gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa seleccionado del grupo que consiste en pgsB, pgsC y pgsA para expresión de superficie y un gen que se liga con el gen de complejo poli-gamma-glutamato sintetasa y codifica una proteína E7 (Rb) de antígeno asociado por inducción a tumor de virus del papiloma humano.

13. Una bacteria de ácido láctico recombinante transformada con el vector según la reivindicación 11.

14. Una bacteria de ácido láctico recombinante transformada con el vector según la reivindicación 12.