Una proteína aislada seleccionada de

(a) una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

23; o

(b) una proteína aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35.

Proteínas que comprenden regiones conservadas del antígeno de superficie de Neisseria meningitidis NhhA.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a proteínas nuevas que constituyen formas modificadas de un antígeno de superficie de Neisseria meningitidis, a ácidos nucleicos que codifican tales péptidos y polipéptidos nuevos, y al uso de estos en diagnóstico, en vacunas terapéuticas y profilácticas y en el diseño y/o cribado de medicamentos. Más particularmente, al tener deleciones de aminoácidos no conservados, los antígenos de superficie modificados de la invención pueden ser útiles en vacunas que inmunizan eficazmente contra un espectro más amplio de cepas de N. meningitidis del que se esperaría de un antígeno de superficie salvaje correspondiente.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis es una bacteria Gram negativa y el agente causante de la meningitis meningocócica y septicemia. Su único huésped conocido es el ser humano, y la puede llevar asintomáticamente aproximadamente el 10% de la población (Caugant et al, 1994, Journal of Clinical Microbiology 32 323) .

N. meningitidis puede expresar una cápsula de polisacáridos y esto permite la clasificación de las bacterias según la naturaleza de la cápsula expresada. Hay al menos doce serogrupos de N. meningitidis: A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y y Z, de los cuales los serogrupos A, B y C causan el 90% de la enfermedad meningocócica (Poolman et al, 1995, Infectious Agents and Disease 4 13) . Las vacunas dirigidas contra los serogrupos A y C están disponibles, pero el polisacárido capsular del serogrupo B es poco inmunogénico y no induce protección en seres humanos.

Por tanto, se está examinando la idoneidad de otros componentes de membrana y extracelulares para su inclusión en vacunas. Los ejemplos incluyen las proteínas de la membrana externa de clases 1, 2 y 3 (porina; codificada por los genes por) y las clases 4 (Rmp) y 5 (proteínas de opacidad; codificadas por los genes opa y opc) .

Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de estos candidatos es capaz de inducir protección completa, particularmente en niños (Romero et al., 1994, Clinical Microbiology Review, 7 559; Poolman et al., 1995, anteriormente) .

Para crear una vacuna eficaz, es necesario identificar componentes de N. meningitidis que estén presentes en una mayoría de cepas, y que sean capaces de inducir una respuesta inmune protectora (por ejemplo, anticuerpos bactericidas) .

A este respecto, se hace referencia a las publicaciones internacionales WO 99/24578, WO99/36544, WO99/58683 y WO99/57280, cada una de las cuales describe un número de proteínas candidatas que podrían ser útiles en vacunas para inmunizar contra Neisseria meningitidis.

A este respecto, se hace referencia particular a la publicación internacional WO99/31132 y Peak et al. 2000, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28 329, cada una de las cuales describe un antígeno de superficie nuevo aislado de un número de diferentes cepas de N. meningitidis, antígeno de superficie, y variantes alélicas del mismo, que para los fines de esta especificación se denominarán como NhhA.

Compendio de la invención

Los inventores presentes han descubierto que el antígeno de superficie NhhA tiene regiones polipeptídicas que son variables entre cepas de N. meningitidis, y otras regiones que están conservadas entre cepas. Las regiones variables pueden ser inmunogénicas y tienden a inducir respuestas inmunes específicas de la cepa, de modo que las vacunas que incorporan un antígeno NhhA derivado de una cepa particular de N. meningitidis tienden a inmunizar preferentemente contra esa cepa particular. Como resultado, los presentes inventores han intentado producir un polipéptido NhhA modificado que induzca una respuesta inmune que no sea tan específica de cepa como la inducida por NhhA salvaje. Este antígeno NhhA modificado será útil para la producción de vacunas terapéuticas y/o profilácticas contra N. meningitidis como se describirá en el presente documento posteriormente. Al dirigir la respuesta inmune principalmente contra epítopos conservados, tales vacunas deben inmunizar eficazmente contra un espectro más amplio de cepas de N. meningitidis del que se esperaría después de la inmunización con NhhA salvaje.

La presente invención, por tanto, se dirige en general a proteínas aisladas que tienen aminoácidos conservados de polipéptidos NhhA.

Por tanto, las proteínas de la invención tienen una o más deleciones de aminoácidos no conservados comparados con un polipéptido NhhA salvaje correspondiente.

En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína aislada seleccionada de

(a) una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; o

(b) una proteína aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, que son “polipéptidos NhhA modificados de la invención”.

La respuesta inmune es menos específica de cepa que la provocada por dicho polipéptido NhhA salvaje correspondiente.

Las secuencias de polipéptidos NhhA salvajes se ejemplifican en la figura 1 (SEQ ID NO: 1 a 10) .

También se muestra una secuencia consenso de aminoácidos en la figura 1 (SEQ ID NO: 11) .

Las regiones constantes de un polipéptido NhhA se designan regiones C1, C2, C3, C4 y C5 en la figura 1.

Las regiones variables de un polipéptido NhhA se designan como regiones V1, V2, V3 o V4 en la figura 1.

Preferiblemente, una región V1, o al menos una parte sustancial de la misma, se deleciona.

También se describen proteínas aisladas que tienen una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las figuras 6 a 9 (SEQ ID NO: 24 a 27) . En la figura 14 (SEQ ID NO: 33 a 39) se proporcionan ejemplos adicionales de polipéptidos “maduros” que se predice que resultan de la eliminación de las secuencias señal Nterminal.

Según un segundo aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido según el primer aspecto.

Las secuencias de ácido nucleico nhhA salvaje se ejemplifican en la figura 2 (SEQ ID NO: 12 a 21) .

También se muestra una secuencia consenso de ácido nucleico en la figura 2 (SEQ ID NO: 22) .

Preferiblemente las regiones C1, C2, C3, C4 y C5 están codificadas por las respectivas secuencias de nucleótidos como se muestran en la figura 2.

Preferiblemente las regiones V1, V2, V3 y V4 están codificadas por las respectivas secuencias de nucleótidos como se muestran en la figura 2.

En una forma de realización particular, el ácido nucleico aislado de la invención tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la figura 5 (SEQ ID NO: 28) que es un ejemplo particular del “ácido nucleico nhhA modificado de la invención”. Se describen ácidos nucleicos adicionales en las figuras 6 a 9 (SEQ ID NO: 29 a 32) , que son ejemplos particulares de los “ácidos nucleicos nhhA modificados de la invención”.

La invención según el primer y segundo aspectos se extiende a proteínas de fusión que consisten en la proteína aislada del primer aspecto y un compañero de fusión que no deriva de N. meningitidis y ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas.

Específicamente excluidos del ámbito de la invención están los polipéptidos NhhA y los ácidos nucleicos nhhA salvajes.

En un tercer aspecto, la invención reside en una construcción de expresión que comprende un vector de expresión y un ácido nucleico según el segundo aspecto, en donde dicha secuencia está operativamente unida a uno o más ácidos nucleicos reguladores en dicho vector de expresión.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula huésped que contiene una construcción de expresión según el tercer aspecto.

En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método de producir una proteína aislada recombinante según el primer aspecto, dicho método comprende los pasos de:

(i) cultivar una célula huésped que contiene un vector de expresión según el tercer aspecto de modo que dicho polipéptido se exprese en dicha célula huésped; y

1. Una proteína aislada seleccionada de

(a) una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; o

(b) una proteína aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35.

2. Una proteína de fusión que consiste en la proteína aislada según la reivindicación 1 y un compañero de fusión que no deriva de N. meningitidis.

3. La proteína de fusión según la reivindicación 2 en donde el compañero de fusión se selecciona del grupo que consiste en proteína A, glutatión S-transferasa, parte Fc de IgG humana, proteína de unión a maltosa, hexahistidina, proteína fluorescente verde, una etiqueta epítopo c-myc, una etiqueta epítopo de hemaglutinina del virus de la gripe y una etiqueta FLAG.

4. Una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas aisladas según la reivindicación 1 o proteínas de fusión de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, y un soporte, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4 que es una vacuna.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína aislada según la reivindicación 1 o la proteína de fusión de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

7. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6 que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:28.

8. Una construcción de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 operativamente unido a un promotor.

9. Una composición farmacéutica que comprende la construcción de expresión de la reivindicación 8 y un soporte, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, que es una vacuna.

11. Una célula huésped que comprende la construcción de expresión de la reivindicación 8.

12. La célula huésped de la reivindicación 11 que es una bacteria.

13. La célula huésped de la reivindicación 12 que es Neisseria meningitidis.

14. Un método de producir una proteína recombinante que incluye los pasos de:

(i) cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 11-13 de modo que dicha proteína recombinante se exprese en dicha célula huésped; y

(ii) aislar dicha proteína recombinante.

15. La proteína aislada de la reivindicación 1 o la proteína de fusión de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por N. meningitidis.

16. La construcción de expresión de la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por N. meningitidis.

17. Uso de la proteína aislada de la reivindicación 1 o la proteína de fusión de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por N. meningitidis.

18. Uso de la construcción de expresión de la reivindicación 8 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección por N. meningitidis.

19. La proteína aislada, proteína de fusión, construcción de expresión o uso de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde la infección por N. meningitidis es en un ser humano.

20. Un método para diagnosticar la infección de un mamífero por N. meningitidis, dicho método comprende los pasos de:

(i) poner en contacto una muestra biológica de un individuo con una proteína aislada según la reivindicación 1

o la proteína de fusión de la reivindicación 2 o la reivindicación 3; y

(ii) determinar la presencia o ausencia de un complejo entre dicha proteína aislada o dicha proteína de

fusión y anticuerpos específicos de N. meningitidis en dicha muestra, en donde la presencia de dicho 5 complejo es indicativa de dicha infección.

21. Un método para detectar N. meningitidis en una muestra biológica obtenida de un paciente, dicho método comprende el paso de usar un ácido nucleico aislado según la reivindicación 6 o la reivindicación 7 para detectar N. meningitidis en dicha muestra biológica.

22. El método de la reivindicación 20, en donde el mamífero es un ser humano.